用于活体光学与磁共振成像的单分子Eu2+/3+配合物平台

《Journal of the American Chemical Society》：Single Molecule Eu2+/3+ Complex Platform for Optical and Magnetic Resonance Imaging In Vivo

　　

镧系（lanthanide）配位配合物因在水相中的氧化稳定性、有利的弛豫（relaxometric）性质以及在生物医学相关的光学成像波长范围内可获得发光发射而被用于生物成像。与依赖交换镧系离子以获取不同模态的多模态成像策略不同，研究人员利用Eu2+/3+这对独特的氧化还原化学性质，证明在同一螯合骨架内实现多模态成像的可行性。研究人员构建了一系列含聚吡啶的大环配体，可容易地配位Eu2+和Eu3+离子。通过X射线晶体学、循环伏安法、电子顺磁共振（EPR）谱学和光物理测量对相应螯合物进行了表征。含 acetamide官能化、含聚吡啶的18元大环的Eu2+配合物表现出与临床Gd3+对比剂相当的磁共振成像弛豫性质。氧化为Eu3+后，配合物显示特征发光，量子产率为1.3%至13.9%。用切伦科夫（Cherenkov）发射放射性核素进行原位敏化，可在与Eu2+增强磁共振成像相当的浓度下高效产生Eu3+发射。在体外磁共振成像研究中提供最大信噪比的配合物，氧化后仅需少至5 nmol配合物即可产生可检测的光学成像信号。随后在小鼠异种移植肿瘤模型中的研究证明，单次给药氧化还原可切换配合物后进行连续磁共振和光学成像实验是可行的。

论文发表在《Journal of the American Chemical Society》。研究背景方面，三价镧系离子在生物医学应用中具备吸引人的性质，如放疗（¹⁷⁷Lu³⁺用于β治疗）、磁共振成像（MRI，Gd³⁺）、光学成像（Eu³⁺、Tb³⁺、Yb³⁺等在临床前模型中已验证）。光学成像中镧系离子因Laporte和自旋禁阻的f–f跃迁而摩尔吸光系数低，常需安装有机发色团（天线）通过Dexter介导的能量转移来敏化；近红外一区（NIR-I）发射的有效三重态敏化能一般＞22000 cm^–1，为避免周围组织与蛋白淬灭，研究人员此前建立了利用切伦科夫辐射（CR，由放射性核素产生，在UV–蓝区强度增加）原位激发镧系配合物的方法。目前镧系多模态成像通常需用不同镧系离子（如Gd³⁺用于MRI，Yb³⁺用于NIR发射和化学交换饱和转移CEST，或Eu³⁺用于双光子显微镜），而同一螯合骨架内利用Eu^2+/3+氧化还原对在活体中实现MRI（Eu²⁺）与光学成像（Eu³⁺）切换的报道很少，且以往涉及铕两态的活体成像仅限于二价态。Eu²⁺与Eu³⁺电子结构不同：Eu²⁺关联4f⁷→4f⁶5d¹跃迁，摩尔吸光系数＞1000 M^–1cm^–1，无需天线敏化，发射宽带＞5000 cm^–1且依赖配体场与溶剂；Eu³⁺具窄f–f发射。二者弛豫与光物理性质互补，有潜力在同一螯合物内实现MRI/光学双模态，但需配体能同时稳定两价态并兼顾各自配位偏好。因此研究人员开展本研究，设计合成灵活的大环配体骨架同时稳定Eu²⁺与Eu³⁺，表征其结构、电化学、弛豫与光物理性质，并在体外及小鼠肿瘤模型中验证单分子双模态连续成像的可行性。结论为：含acetamide臂的18元冠醚-聚吡啶大环配体可形成惰性Eu²⁺/Eu³⁺配合物；Eu²⁺配合物弛豫率与临床Gd³⁺对比剂相当，可实现T₁加权MRI；氧化为Eu³⁺后具可观量子产率，可用切伦科夫辐射能量转移（CRET）实现光学成像；单次给药后在小鼠模型中可先做MRI（Eu²⁺态），待氧化后再做CRET光学成像（Eu³⁺态），证明单分子氧化还原切换双模态成像可行。意义在于建立了利用Eu^2+/3+氧化还原对作为氧化还原响应MRI/光学成像剂、无创检测缺氧环境及在活体内保持螯合结构框架的策略，为后续提高Eu²⁺持久性以用于系统注射和 redox状态监测奠定基础。

主要关键技术方法：研究人员合成系列配体（Phen18c6、PhenDMA、Phenacetate、Phencrypt、Bipy18c6、BipyDMA）并通过还原胺化、烷基化等步骤制备；配合物由相应铕卤盐在无氧（Eu²⁺）或常规（Eu³⁺、Gd³⁺、⁶⁸Ga等）条件下形成；结构表征采用单晶X射线衍射与SHAPE分析；电化学用循环伏安法（甲醇，LiCl支持电解质，参比二茂铁/二茂铁⁺）；电子顺磁共振（EPR）在15 K冰冻水相介质X波段测试；光物理表征包括UV–Vis吸收、稳态/时间分辨发光（H₂O/D₂O中寿命求内球水合数q via Horrocks方程）、量子产率（参照tris(dipicolinato)europium(III)及奎宁硫酸盐）、低温（77 K）磷光测三重态能级（用Gd³⁺类似物）；弛豫测量在1.4 T测定纵向弛豫率r₁；体外T₁加权MRI在4.7 T小动物扫描仪用浓度梯度样品；光学成像用⁶⁸Ga作为切伦科夫辐射源进行CRET敏化，620 nm滤光收集Eu³⁺的⁵D₀→⁷F₂发射；体内实验采用小鼠RM1-PGLS前列腺肿瘤异种移植模型（皮下右肩），先无氧条件下制备[Eu(BipyDMA)]²⁺瘤内注射，4.7 T连续T₁加权MRI扫描观察对比变化，待氧化后注射[⁶⁸Ga]GaCl₃进行光学成像，并设置对照。

研究结果部分：

Chemical Synthesis：研究人员考察了先前配体骨架对Eu^2+/3+的包容性，cryptands虽稳定Eu²⁺但对Eu³⁺亲和弱，四氮大环Eu²⁺热力学稳定性较低但位阻可增强动力学惰性。为平衡两态配位与电子偏好，提出柔性二氮-18-冠-6功能化配体架构，聚吡啶敏化基团整合到冠骨架上，acetamide臂提供灵活性以适应Eu²⁺与Eu³⁺。合成了Phen18c6经氧化、还原胺化得，再烷基化为PhenDMA（溴-N,N-二甲基乙酰胺）或Phenacetate（溴乙酸乙酯/脱保护）；另合成Phencrypt大环（高稀释宏环化）、Bipy18c6与BipyDMA类似路线。配合物制备：Eu²⁺配合物在无氧下用EuX₂（X=Br,I）于乙腈或水/甲醇中反应分离；Eu³⁺类似物常规条件，Phen18c6与Phencrypt需在乙腈回流实现配位。得到一系列Eu²⁺/Eu³⁺配合物，acetamide配体水溶性好。

Structural Characterization：单晶X射线分析比较不同配体与氧化还原态结构。[Eu(Phencrypt)(H₂O)₂]I₂为十配位，扭曲多面体近交错十二面体（D₂对称，偏差6.588%），键长与已知Eu²⁺配合物相符；对应Eu³⁺配合物[Eu(Phencrypt)Br]Br₂九配位具呼啦圈几何（C_s对称，偏差2.892%），Eu–N/Eu–O比二价态收缩。PhenDMA的Eu³⁺结构[Eu(PhenDMA)Br]OTf₂与[Eu(PhenDMA)I]I均为九配位内球卤离子，Eu³⁺态更近松饼几何（Cs对称偏差3.055%）比二价态（8.648%偏差）规整；键长符合三价铕。表格列出[Eu(BipyDMA)I]I、[Eu(PhenDMA)I]I、[Eu(PhenDMA)Br]OTf₂的Eu–N（酚/联吡啶）、Eu–O、Eu–amide、Eu–X键长与amide–Eu–amide角，二价相比三价Eu–O与Eu–N^phen伸长支持二价态。BipyDMA与PhenDMA结构近乎一致，Bipy的Eu–N^bipy比Phen的Eu–N^phen长约0.04 ?。结构显示acetamide螯合物具柔性容纳两价态。研究人员指出Eu–N^phen短于Eu–N^aliph但不支持中间价态说法，综合结构与EPR等电子表征否定了中间价可能。

Spectroscopic and Electrochemical Characterization：X波段EPR在15 K冰冻水相中测，Eu³⁺EPR静默，Eu²⁺具⁸S_7/2基态适合EPR，g值～4.7（偏离各向同性S态g≈2），归因于显著零场分裂与低对称性 rhombicity。循环伏安法（甲醇，LiCl 100 mM）以Fc/Fc⁺为内标：系列Eu²⁺配合物阳极峰电位均负于Eu²⁺水合离子；[Eu(Phencrypt)]²⁺最正（–0.83 V vs Fc/Fc⁺），PhenDMA与BipyDMA分别为–0.87 V与–0.86 V；表明配体电子与空间效应影响氧化还原电位，这些电位比自由离子负但不到还原水的程度，研究人员假设Eu²⁺配合物在低氧肿瘤缺氧环境中可持久存在从而实现MRI对比增强。

Photophysical Characterization：聚吡啶可敏化Ln³⁺发光，配体设计将聚吡啶直接整合到大环。Phen配合物UV–Vis λ_max=279 nm在配位后不变，Bipy螯合物较自由配体蓝移4200 cm^–1（λ_max=315 nm）。Eu³⁺配合物发射归一化到⁵D₀→⁷F₁磁偶极带（场不敏感）以观察 hypersensitivity⁵D₀→⁷F₂变化；激发天线π→π*（Phen 279 nm，Bipy 315 nm）敏化Eu³⁺发光；所有化合物显示⁵D₀→⁷F₀带（指示C_s、C_n或C_nv对称），与晶体对称一致。用H₂O/D₂O寿命与Horrocks方程（A=1.2 ms，B=0.25 ms^–1for Eu³⁺）求内球水合数q：PhenDMA Eu³⁺q=0.45，BipyDMA Eu³⁺q=0.43，Phenacetate Eu³⁺q=0.93，Phencrypt Eu³⁺q=0.76，Phen18c6 Eu³⁺q=3.16；晶体无内球水但溶液中卤离子可能被水置换，acetamide配合物q≈0.4~0.45暗示溶液中q=0与q=1物种平衡。量子产率φ：PhenDMA Eu³⁺φ=13.9±0.4%，Phenacetate 10±1%，Phencrypt 4±1%，Phen18c6 1.4±0.1%，BipyDMA Eu³⁺参照奎宁硫酸盐为1.3±0.1%（但与tris(dipicolinato)europium(III)参照得9±2%），φ随q增加而降低（内球水O–H振荡淬灭）。低温（77 K）Gd³⁺类似物磷光得三重态能级：PhenDMA 22051 cm^–1，BipyDMA 22484 cm^–1，排除BipyDMA低φ因三重态失配的可能，低φ当参照奎宁时可能是发射轮廓不匹配导致低估。Eu²⁺配合物吸收宽带延伸至可见区（＞500 nm），摩尔吸光11–280 M^–1cm^–1，水溶液红棕色；340 nm激发未见Eu²⁺的4f–5d发射（淬灭），暴露于空气后恢复Eu³⁺的f–f发射；卤离子抗衡离子不影响光物理性质。

T₁-Relaxivity and T₁-Weighted Imaging：在1.4 T测Eu²⁺配合物纵向弛豫率r₁并对比对应Gd³⁺配合物（氧化不敏感参照）：Gd(PhenDMA)³⁺r₁=3.17 mM^–1s^–1，Gd(BipyDMA)³⁺r₁=1.07 mM^–1s^–1；Eu(PhenDMA)²⁺r₁=2.49 mM^–1s^–1，Eu(BipyDMA)²⁺r₁=2.43 mM^–1s^–1，与Gd类似物相当（PhenDMA系列更高）。差异不因q（对应Eu³⁺的q近似），可能源于晶体中Eu–I键Bipy比Phen长0.04 ?，更小离子半径Gd³⁺放大此差异影响水配位与弛豫；Eu²⁺低电荷密度加快水交换但影响次要；另外Eu²⁺与聚吡啶配体间氧化还原活性（不存在于Gd³⁺）使严格比较复杂。体外T₁加权MRI（4.7 T）浓度0.05–0.25 mM在MOPS缓冲液：Eu(PhenDMA)²⁺与Eu(BipyDMA)²⁺增强对比，Eu(BipyDMA)²⁺信噪比（SNR）与Gd类似物相当；暴露于空气30分钟内T₁增强完全消失（Eu²⁺→Eu³⁺氧化）。

Optical Imaging Experiments：用⁶⁸Ga（～10 μCi）作为切伦科夫辐射源进行CRET敏化光学成像，监测Eu³⁺的⁵D₀→⁷F₂带（620 nm滤光）。Gd³⁺配合物无发光；Eu³⁺配合物（PhenDMA、BipyDMA）浓度0.1–50 nmol（0.005–0.025 mM）高于检测限（1–5 nmol间），虽BipyDMA的φ（参照tris(dipicolinato)europium(III)）略低于PhenDMA，但检出限无差别，支持用tris(dipicolinato)europium(III)参照更合理。证明Eu³⁺配合物在CRET下适于低浓度光学成像。

In Vivo Validation of Bimodal Imaging：选用RM1-PGLS前列腺肿瘤异种移植小鼠（右肩皮下），单次瘤内注射无氧制备的[Eu(BipyDMA)]²⁺（1.0 mM，100 μL，100 nmol）后立即4.7 T连续T₁加权MRI（4分钟间隔）：肿瘤下半部出现亮T₁对比，16分钟后回复本底（Eu²⁺氧化为Eu³⁺）。随后注射[⁶⁸Ga]GaCl₃（40 μL，52 μCi）做光学成像（620 nm），保留的氧化态[Eu(BipyDMA)]³⁺高效CRET敏化发射特征发光，对照（⁶⁸Ga+生理盐水）无此信号。证明单剂量顺序MRI（Eu²⁺态）→氧化→光学成像（Eu³⁺态，CRET）在活体可行。

讨论与结论翻译：研究人员设计、合成并表征了具柔性acetamide臂的18元大环冠醚（BipyDMA）可配位Eu在+2与+3氧化态。尽管配位聚吡啶淬灭Eu²⁺关联的4f–5d发光，但晶体学与EPR肯定二价态存在，且不影响Eu²⁺磁/电化学性质和Eu³⁺光物理性质。Eu²⁺配合物[Eu(BipyDMA)]²⁺产生与Gd³⁺对比剂相当的弛豫率与T₁对比增强；对应Eu³⁺配合物[Eu(BipyDMA)]³⁺产生适于CRET光学成像的发光（浓度同Gd增强MRI典型值）。小鼠异种移植模型单探针双模态实验证实[Eu(BipyDMA)]^2+/3+用作单次给药顺序MRI与光学成像对比剂在活体可行。研究建立了利用Eu^2+/3+氧化还原对作为氧化还原响应MRI/光学成像剂以无创检测缺氧环境及在活体内两态保持螯合结构的框架。瘤内注射后[Eu(BipyDMA)]²⁺氧化在成像时间尺度可观察，未来工作将聚焦提高Eu²⁺配合物持久性以允许系统注射与 redox状态监测。