能量耦合因子(ECF)转运体抑制剂作为新型抗生素的从命中到先导优化

《Journal of Medicinal Chemistry》：Hit-to-Lead Optimization of Energy-Coupling Factor (ECF) Transporter Inhibitors as Novel Antibiotic

　　

对先前鉴定的一类能量耦合因子(ECF)转运体抑制剂进行多参数优化，证实了其体内药效。ECFs是一类跨膜蛋白，在必需营养物质跨细胞膜的主动转运中起关键作用，因此在对抗抗菌药物耐药性(AMR)方面具有重要意义。为了改善该类抑制剂的药物样性质，研究人员利用点击化学，围绕起始分子3的东部区域进行了聚焦的结构-活性关系(SAR)研究。多参数优化得到了代谢稳定性和溶解度提高的化合物，对一组革兰氏阳性菌和ECF转运体均具有强效活性。研究人员进一步以粪肠球菌(Enterococcus faecium)为模型生物证明了快速杀菌作用，并在大蜡螟(Galleria mellonella)幼虫和斑马鱼(Danio rerio)感染模型中证实了最优化合物的体内药效，突出了该方法学的治疗潜力。

抗菌药物耐药性（AMR）的持续蔓延严重威胁全球公共卫生，而新型抗菌药物的开发因经济成本问题长期停滞。现有靶标和药物作用模式易产生交叉耐药，亟需发掘全新作用机制的先导化合物。能量耦合因子（ECF）转运体是一类主要存在于革兰氏阳性菌（如粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌）中的跨膜蛋白，负责多种维生素的主动摄取；由于其在人体中无同源蛋白，因而成为极具潜力的抗菌新靶点。先前研究人员通过基于结构的虚拟筛选（SBVS）和靶向动态组合化学（tdDCC）获得了初步的ECF抑制剂，但这些命中的药物样性质（尤其是代谢稳定性）较差，限制了体内药效验证。为此，该研究以化合物3为起点，针对其东部区域开展多参数优化，旨在同时提升靶点抑制活性、代谢稳定性和溶解度，最终获得具有体内活性的候选分子。论文发表在《Journal of Medicinal Chemistry》。

该研究主要采用了以下几项关键技术方法：（1）点击化学（铜催化的叠氮-炔环加成，CuAAC）与Suzuki交叉偶联反应，用于高效合成31个新型二取代或单取代水杨酸衍生物；（2）全细胞摄取实验（以Lactobacillus casei为模型，放射性标记底物）测定IC₅₀，评价对ECF-FolT2的抑制活性；（3）蛋白酶脂体摄取实验（Lactobacillus delbrueckii来源的ECF-FolT2和ECF-PanT）确认靶点选择性及变构作用模式；（4）微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC），针对一组革兰氏阳性菌包括青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP）和万古霉素耐药屎肠球菌（VRE）；（5）时间杀菌曲线分析（以E. faecium ATCC51559为模型）；（6）体外ADMET评估：包括动力学溶解度、logD_7.4、小鼠和人类肝微粒体及S9部分代谢稳定性、血浆稳定性、HepG2/A549细胞毒性、hERG-K⁺通道抑制；（7）体内活性验证：大蜡螟（G. mellonella）幼虫感染肺炎链球菌模型及斑马鱼（D. rerio）胚胎感染屎肠球菌模型。研究使用的微生物菌株均购自DSMZ或ATCC标准菌株库。

**SAR Study**
以化合物3为起点，首先合成7个脂肪族和卤代衍生物（5-10）替换双叔丁基，发现所有生物电子等排体（如氯、溴、三氟甲基、环丙基、三氟乙基）均导致全细胞抑制活性下降（3的抑制率73% vs 5-10中最高仅68%）。转而引入五元/六元杂环：通过Suzuki偶联及CuAAC反应获得二取代衍生物11-18及单取代衍19-29。结果表明，二取代3-氯-2-异丙氧基吡啶基衍生物18活性最强（IC₅₀=4±1.5 μM），而单取代系列活性普遍降低，证实双取代模式对活性至关重要。

**Exploration of 1,4-Triazole-Pyridinyl Hybrids**
基于化合物18（溶解度略低：108 μM，logD_7.4=4.66），引入不对称双取代策略：一侧保留3-氯-2-异丙氧基吡啶，另一侧引入1,2,3-三唑环以改善亲水性。合成了30-36系列在4位不同取代的三唑衍生物。全细胞摄取实验显示，除含二甲基氨基的35外，其余化合物（30-34, 36）均展现单微摩尔IC₅₀（30: 6.4±1.8 μM; 31: 4.2±0.3 μM; 33: 4.4±0.4 μM; 36: 3.2±0.2 μM）。

**Docking Studies**
将18、33、36与参考配体1对接到ECF-PanT（PDB ID: 6ZG3）中。结果显示所有化合物均保留与S-组分Arg77的盐桥作用；18通过其吡啶环上的氯原子与EcfT模块的Ile160形成卤键，并新增与Thr28、Met126、Phe171的疏水接触；33的噻吩环与S-组分的Val20、Val69、Leu76及EcfT的Phe29、Ile33产生疏水作用；36的叔丁基三唑与S-组分的Leu24及EcfT的Ala163形成双疏水作用，异丙氧基与EcfT的Thr127相互作用。这些额外的配体-靶标相互作用解释了活性提升。

**Antibacterial Potency, Confirmation of On-Target Activity, and Time-Kill Kinetics of Selected Frontrunner Molecules**
对最优化合物18、31、33、34、36进行MIC测定：它们对E. faecium DSM-20477的MIC值在1-4 μg/mL，对S. pneumoniae PRSP的MIC低至0.3-0.6 μg/mL，相比起始化合物3（MIC>16 μg/mL）提升10倍以上。蛋白酶脂体摄取实验确认这些化合物同时抑制ECF-FolT2和ECF-PanT（150 μM时抑制率74-100%），表明其靶向II型ECF转运体。选择36进行时间杀菌动力学研究：在2×、4×、8×MIC下1小时内即显示杀菌作用，并在24小时内持续>3 log CFU/mL减少，最低杀菌浓度（MBC）为17.2 μg/mL（2×MIC）。

**In Vitro ADMET Profiling**
对比化合物3与18、31、33、36的ADMET参数：3在小鼠和人肝微粒体中快速代谢（CL_int分别为27和264 μL/min/mg）；新化合物（31、33、36）在小鼠和人肝微粒体中均表现出超过2小时的半衰期（t_1/2>120 min，CL_int<11.6 μL/min/mg），且血浆稳定性均>240 min。动力学溶解度方面，36恢复到>200 μM，logD_7.4降至1.73。HepG2细胞毒性CC₅₀在88-93 μM范围，A549细胞活性无显著抑制（>80%存活率）。hERG-K⁺通道抑制率在10 μM时均<15%，无心脏毒性风险。选择性指数（SI）从化合物3的2.4提升至36的32.5倍。

**In Vivo Activity of Optimized ECF Inhibitors in G. mellonella and Danio rerio Infection Models**
在大蜡螟幼虫肺炎链球菌感染模型中，50 μM的18、31、33、36共处理可将幼虫存活率从50%（感染对照）提升至65%（18和31）或62%（36）；且在200 μM时无毒性。在斑马鱼胚胎屎肠球菌感染模型中，50 μM的36通过水体暴露处理使存活率从30%（溶剂对照）显著增加至40%（P<0.05），而阳性对照利奈唑胺（400 μM）的存活率为90%。尽管36的疗效逊于利奈唑胺，但这是首次在脊椎动物模型中验证ECF抑制剂的体内活性，且受限于水暴露给药方式和溶解度限制。

**总结讨论**：该研究通过系统的SAR研究，将起始化合物3的双叔丁基替换为1,2,3-三唑-吡啶杂化结构，利用点击化学合成了31个新衍生物，成功解决了代谢稳定性问题，并同时提升了靶点抑制活性和抗菌活性。多参数优化后的先导分子（31、33、36）在体外ADMET、革兰氏阳性菌MIC（亚微摩尔级别）、时间杀菌动力学及体内模型中均展现出显著改善。分子对接揭示了活性增强源于与ECF模块及S-组分更多残基的相互作用。尽管在斑马鱼模型中未达到极高效力，但36处理组与溶剂对照组的统计学显著差异证实了ECF转运体作为抗菌靶点的体内可行性。该工作为开发靶向ECF转运体的新型抗生素奠定了基础，标志着抗AMR研究的重要进展。
**研究结论（翻译）**：总之，研究人员从先前报道的抑制剂系列3出发开展了广泛的SAR研究，该系列因其双叔丁基部分而具有较差的代谢稳定性。研究人员通过一个包含31个新化合物（5-36）的详细SAR研究解决了这一点，其中1,4-三唑基环的引入尤其推荐。使用点击化学作为一种通用方法，产生了一组分子，克服了起始点的弱点，正如化合物31、33和36在体外ADME-T研究中表现出的优越特征所证明的那样。此外，这些新化合物在一组革兰氏阳性菌中具有亚微摩尔细胞活性，同时保持靶点活性。活性提升已通过对接研究得到合理化，揭示了在ECF模块和S-组分内额外的配体-靶标相互作用。研究人员首次研究了在屎肠球菌中24小时的时间杀菌动力学，发现化合物36具有杀菌活性。然后，研究人员在大蜡螟中确认了先导化合物的活性，此前已报道过化合物3和4，但在这里研究人员还检查了它们在斑马鱼感染模型中的行为。尽管未观察到极佳药效，但该研究为这类化学系列的未来发展奠定了基础。溶剂处理组与36处理组之间的统计学显著效应提供了证据，表明化合物36靶向ECF转运体并具有体内活性。上述结果代表了靶向ECF转运体的抗感染药物开发的一个重要里程碑，也标志着抗AMR领域的重大进展。