基于CD8lo与CD8hi胰腺导管腺癌小鼠模型及人源样本的胞外基质(ECM)蛋白质组学定义Matrisome（基质体）特征

《Cancer Research Communications》：Proteomic definition of the matrisome of CD8lo and CD8hi... Open Access

胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）是环绕细胞的复杂蛋白组装体，是肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）的关键组分，在肿瘤进展及调控治疗应答中发挥主动作用。胰腺导管腺癌（Pancreatic Ductal Adenocarcinoma, PDAC）预后极差，常于晚期确诊，其特征为极密集的ECM阻碍药物递送，且属"冷"肿瘤（"cold" tumors），无法引发强免疫应答，使免疫疗法面临挑战。然而PDAC中ECM与免疫细胞间的相互作用仍不清楚。本研究利用ECM聚焦蛋白质组学分析具不同CD8+T细胞浸润水平的PDAC小鼠模型的ECM组成，发现CD8lo（冷肿瘤）与CD8hi（热肿瘤）呈现不同ECM谱。检索公共人PDAC单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据集进一步揭示，区分冷热PDAC的ECM蛋白由多种基质细胞群分泌，包括癌相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs）、星状细胞及巨噬细胞。最后，编码CD8lo表型特征ECM蛋白的部分基因表达量与国人PDAC样本中CD8+T细胞浸润及患者生存相关。本研究为开发ECM调控干预手段以增强免疫细胞浸润及免疫治疗响应奠定基础。 意义：研究人员报道了小鼠PDAC模型及人样本中关联CD8+淋巴细胞浸润水平的ECM蛋白特征，为开发ECM调控治疗策略向促进淋巴细胞浸润进而提升免疫疗效铺平道路。

《Cancer Research Communications》：PDAC冷热肿瘤ECM Matrisome蛋白质组学特征研究解读

一、研究背景与立题依据

胰腺导管腺癌（Pancreatic Ductal Adenocarcinoma, PDAC）是预后最差的恶性肿瘤之一，特征为过量胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）沉积即促结缔组织增生（desmoplasia）及免疫抑制性的"冷"肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME），CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞浸润匮乏致使免疫检查点抑制剂疗效甚微。虽然ECM已知可影响TME免疫组分，但具体哪些ECM成分关联CD8⁺T细胞浸润及如何差异分布于冷热PDAC中尚不明晰。既往研究多关注总胶原含量，缺乏对ECM全组分的Matrisome（基质体，指ECM及其关联蛋白的集合）水平比对。因此研究人员开展本研究，利用Kras^LSL-G12D/+; Trp53^LSL-R172H/+; Pdx1-Cre; Rosa26^YFP/YFP（KPCY）来源的小鼠PDAC细胞系构建皮下CD8^lo（冷）与CD8^hi（热）肿瘤模型，通过ECM富集蛋白质组学鉴定差异Matrisome特征，并在人PDAC scRNA-seq及TCGA（The Cancer Genome Atlas）队列中验证其细胞来源及临床相关性，旨在为ECM调制（matritherapy）改善免疫浸润提供靶点。

二、主要关键技术方法概述

研究人员选用KPCY来源CD8^lo（TC3、TC4）与CD8^hi（TH2、TH3）细胞系皮下移植至C57BL/6雌鼠，各取5个独立肿瘤（n=10/组）。采用五步顺序提取去除胞内可溶性蛋白进行ECM富集，经Western Blot验证后酶解肽段，高pH反相色谱分馏，液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography coupled to Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS）检测，MaxQuant搜库、Scaffold校验（蛋白鉴定FDR<1%，≥2条独特肽），以总前体离子强度做无标记定量（Label-Free Quantification, LFQ）。免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）及天狼猩红/Masson三色染色评估胶原与ECM蛋白分布，HALO软件量化。利用STRING做蛋白互作（Protein-Protein Interaction, PPI）、Reactome通路富集、ChEA3转录因子（Transcription Factor, TF）富集。人PDAC公开scRNA-seq（GSA: CRA001160）分析Matrisome基因细胞来源。TIMER2.0及ssGSEA（single-sample Gene Set Enrichment Analysis）分析TCGA PAAD中ECM基因与CD8⁺T细胞浸润关联，Cox比例风险模型与Kaplan–Meier评估生存。

三、研究结果

Characterization of the stromal composition of CD8^loand CD8^hisubcutaneous KPCY PDAC

研究人员证实TC3/TC4为CD8^lo、TH2/TH3为CD8^hi肿瘤；CD8^lo肿瘤α平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin, αSMA）⁺CAFs较少、F4/80⁺巨噬细胞与Ly6G⁺中性粒细胞较多；天狼猩红与Masson三色染色均显示CD8^lo肿瘤纤维胶原ECM含量显著更高（P<0.05）。提示冷肿瘤虽CAFs少但胶原更稳定或产胶原/抑制降解的其他机制占主导。

Proteomics identifies signatures correlating with CD8 lymphocyte infiltration

ECM富集后经LC-MS/MS平均每样本鉴定约150种Matrisome蛋白（核心Matrisome含ECM糖蛋白、胶原、蛋白聚糖占约60%；Matrisome关联蛋白含ECM亲和蛋白、ECM调节因子、分泌因子占约40%）。CD8^loMatrisome共130种蛋白，CD8^hi共122种，二者重叠114种。差异分析定义CD8^lo特征16种（核心Matrisome：Agrn、Dmbt1、Fbln5、Igfbp4、Igsf10、Thbs3；Matrisome关联：含Mmp9、脯氨酰羟化酶P4ha1与P4ha2等），CD8^hi特征8种（含Loxl2、Postn、Col8a1、Tgfbi等）。定量差异蛋白集构成CD8^lo特征21种、CD8^hi特征15种。Fbln5与MMP9在CD8^lo胞外检出而CD8^hi缺如；Col8a1在CD8^hi胞外检出；Tgfbi在CD8^lo呈胞内溶解性、CD8^hi呈ECM不溶性沉积，IHC验证与蛋白质组吻合。

Signature analysis reveals different pathways activated in CD8^loand CD8^hiPDAC tumors

STRING显示冷热ECM特征各自形成不同网络。Reactome富集：CD8^lo特征富集胶原形成通路及凝血/纤维蛋白溶解模块；CD8^hi特征富集弹性纤维形成及ECM降解通路，含TGFβ信号相关分子（Ltbp2、Tgfbi、Fbn2）。ChEA3分析显示调控CD8^loMatrisome基因的主要转录因子为ATF5、TIGD2、CREB3L1、EGR2等；调控CD8^hiMatrisome的为FOXC2、PRRX2、FOXS1等；仅OSR1（odd-skipped related 1）共同调控两组分。

Immunostaining assessment of the distribution of ECM proteins in CD8^loand CD8^hiPDAC tumors

选取Fbln5、MMP9（冷特征）与Col8a1、Tgfbi（热特征）做IHC，分布模式与质谱定量一致：Fbln5与MMP9特异性定位于CD8^lo肿瘤间质区，Col8a1定位于CD8^hi肿瘤间质区，Tgfbi在CD8^lo为胞内、CD8^hi为ECM沉积，佐证蛋白质组发现的亚型特异性ECM空间分布。

Multiple cell populations of the TME contribute to the human PDAC matrisome

基于人PDAC scRNA-seq，冷特征基因（AGRN表达于导管细胞1/2及内皮细胞；FBLN5于成纤维细胞及内皮细胞；MMP9于巨噬细胞及导管细胞2；THBS3于星状细胞及成纤维细胞；S100A10于导管细胞1/2及巨噬细胞亚群）与热特征基因（COL8A1、COL8A2、LTBP2、POSTN、TGFBI主要表达于CAFs，部分LTBP2/POSTN亦见于星状细胞/内皮细胞，TGFBI见于星状细胞/巨噬细胞/导管细胞2）均由多类基质及肿瘤细胞群共表达，说明TME中Matrisome为多元细胞协作产物。

Matrisome gene signatures correlate with CD8⁺T-cell infiltration in human PDAC

ssGSEA显示热Matrisome基因集与细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte, CTL）特征正相关（r=0.33），冷Matrisome基因集相关性弱（r=0.09）。TIMER分析：热特征基因COL14A1、ADAMTSL1、LTBP2、FBLN2、THSD4表达与CD8⁺T细胞浸润正相关；冷特征基因AGRN、P4HA1、P4HA2、IL1RN、S100A10表达与CD8⁺T细胞浸润负相关。

The cold matrisome gene signature correlates with patient outcome

TCGA PAAD中高表达冷特征基因（ANXA1、IL1RN、P4HA1、S100A10）患者总生存（Overall Survival, OS）更差（Cox模型校正基质分数仍显著）；高表达全冷Matrisome基因集评分患者OS显著缩短（P_adj=0.0191），热Matrisome基因集评分与OS无显著关联。

四、讨论与结论总结

研究人员讨论指出：①本研究通过ECM聚焦蛋白质组学首次定义PDAC冷热肿瘤Matrisome差异特征，CD8^lo肿瘤富含胶原稳定相关酶P4ha1/2及Fbln5、Mmp9等，CD8^hi肿瘤富含Loxl2、Postn、Col8a1、Tgfbi等弹性纤维/ECM调节分子；②CD8^lo虽αSMA⁺CAFs少但胶原含量高，可能与胶原翻译后修饰（羟脯氨酸化）增强稳定性有关；③人scRNA-seq证实多细胞群共贡献Matrisome；④部分冷特征基因表达负关联CD8⁺T细胞浸润且预示不良预后；⑤热特征Matrisome蛋白（如Col VIII、Periostin）可作免疫"热"肿瘤靶向锚定ICI（Immune Checkpoint Inhibitors）递送的候选ECM配体；⑥Matrisome谱不仅可作免疫表型标志物，也为Matritherapy（ECM调制疗法）靶向上调免疫许可性ECM或下调免疫排斥性ECM提供基础。

结论（翻译）： 本研究利用ECM聚焦蛋白质组学流程鉴定了小鼠PDAC冷热肿瘤模型中关联淋巴细胞浸润的蛋白特征，发现CD8^lo（冷）与CD8^hi（热）肿瘤具不同ECM组成，并证明TME中多类细胞群表达编码这些蛋白的基因。冷Matrisome基因特征表达与患者不良生存相关。本研究为开发调制ECM组成以促进抗肿瘤免疫细胞招募及活化、从而提升免疫疗法疗效的Matritherapy奠定基础。具CD8^hi肿瘤Matrisome的深度表征亦可用于设计以ECM蛋白为靶向锚定的治疗载荷递送系统，以增强疗效并降低脱靶毒性。