受生物启发的丝素蛋白-儿茶酚-酶共组装体：拼图式构象锁定的生物活性-生物催化平台

《Bioactive Materials》：Bioinspired silk–catechol–enzyme co-assemblies as jigsaw-designed conformation-locking bioactive-biocatalytic platforms

　　

固定化酶为可溶性催化提供了可持续、经济高效的替代方案，但一个能够同时保持天然构象、稳定性并具有广泛酶/材料适应性的通用平台仍有待开发。研究人员报道了一种简便、通用的拼图式设计平台，通过共组装丝素蛋白（silk fibroin, SF）、原儿茶醛（protocatechualdehyde, PA）和酶来实现。受贻贝启发的PA将SF重塑为富含β-折叠的"纳米口袋"以构象锁定生物酶，同时其醛基和儿茶酚基团分别锚定酶和表面，产生了结构和功能上可适应的生物活性-生物催化自组装体。该平台赋予了卓越的稳定性：酶在50 °C下耐受20次循环，并在常温储存一年后仍保留47.7%的活性。该组装体可容纳多种酶（碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, GOx）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）），普遍粘附于固体表面、金属有机框架（metal-organic frameworks, MOFs）和液态金属微球，并可编程为涂层、薄膜或水凝胶。合理的酶选择实现了仿生矿化（ALP）、抗氧化（SOD/CAT）和抗菌活性（GOx）。级联酶在空间有序的核心-壳层纳米颗粒中的排布实现了门控催化，而在导电载体上的空间分离则促进了酶介导的电化学腐蚀控制。此外，这些生物界面组装体在体外/体内引发了良好的细胞粘附、生物相容性以及抗炎/抗感染效应。该模块化平台为面向先进生物应用的高性能催化生物活性材料提供了通用蓝图，并可 readily 扩展至固定肽类等其他功能生物分子。

酶作为自然界精妙的催化杰作，能够在温和条件下实现高度选择性和可持续的化学转化，支撑着广泛的生物制药和生物医学应用。然而，其实际应用受到构象脆弱性、高昂生产成本及低效可回收性的严重制约，这些缺陷增加了运营成本，也与循环经济原则相悖。将酶固定于固体载体可将可溶性催化剂转化为可重复使用的非均相系统，从而克服上述障碍，但现有策略存在固有权衡：弱物理相互作用导致酶泄漏，共价偶联有构象畸变风险，而传统多孔载体则存在传质限制和底物通用性差的问题。因此，一个能够同时保持酶天然构象、确保稳定性并适应多种酶和材料界面的简便、可适应的生物活性包埋系统仍是未满足的需求，这驱动了先进固定化基质与策略的理性设计。

保持酶的天然构象对于维持催化活性至关重要，因为变性是功能丧失的首要原因。基于此，将脆弱蛋白包埋于具有明确刚性二级结构（如β-折叠）的聚合基质中以限制有害构象波动是一种理性策略。丝素蛋白（SF）是一种来源于家蚕（Bombyx mori）茧的生物相容性蛋白，为此提供了典范的天然支架。在构象上，SF通过其重复肽基序的氢键和疏水堆积作用组装成广泛且机械稳固的β-折叠晶体域。值得注意的是，这些结构域可组织成纳米级"口袋状"结构以包埋和保护生物分子，为酶稳定化提供了保护性且动态的微观环境。

除构象稳定化外，实用的固定化平台还必须实现对多种材料表面的强韧且通用的粘附，以适应生物传感器和医疗植入物等应用。自然界为此提供了解决方案：海洋贻贝通过富含儿茶酚的蛋白牢固粘附于固体表面，其中3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）的儿茶酚基团通过共价或金属配位、氢键、π-π相互作用等多种作用实现稳健的界面粘附。这一特性启发研究者将儿茶酚及其衍生物多酚引入多种材料体系以增强内聚力或底物粘附。关键的是，儿茶酚不仅作为表面锚定的分子桥，还被证实能主动诱导和增强SF中的β-折叠形成，这一特性可被利用以放大上述保护性分子口袋的生成。

研究人员选择原儿茶醛（PA）作为功能分子，因其独特的分子结构和反应活性：它独特地结合了用于通用表面锚定的儿茶酚基团，以及能够与SF或酶上的氨基形成动态席夫碱（Schiff base）连接的反应性醛基功能。此外，PA本身具有抗炎和抗氧化特性，进一步拓展了平台的功能范围。

整合SF和PA产生了一个协同的"拼图式"共组装固定化平台，同时解决了构象稳定性和界面粘附问题。其可适应的模块化架构能够在同一β-折叠富集基质中按需包埋多种酶（包括多酶级联系统），而PA介导的动态共价锚定确保了对几乎所有材料表面的稳健固定化。与现有生物催化杂化材料（如酶-金属/共价有机框架复合材料）相比，SFPA系统提供了水合、柔性的基质，能更好地保持天然催化构象并促进传质。此外，不同于受限于底物兼容性且需要复杂多步合成或预处理的传统依赖载体的系统，SFPA平台能够实现一步法、底物无关的粘附，覆盖金属、聚合物、无机非金属和半导体，无需专门化学处理或繁琐加工。其形态可编程性使涂层、薄膜、微球或水凝胶的制备仅需通过调节SF/PA比例、添加剂和组装模板等参数即可实现，为不同应用提供了卓越的加工性和灵活性。

在该研究中，研究人员首先通过综合实验和计算方法探究了SF-PA自组装行为，阐明了SF与PA之间的分子相互作用以及PA介导的β-折叠重塑与动态共价锚定的机制。与传统多酚-丝素系统主要依赖氢键不同，PA的双功能性——融合用于通用粘附的儿茶酚基团和用于动态席夫碱形成的醛基——实现了协同的共价-非共价交联网络。这一独特特征导致了β-折叠"纳米口袋"的形成，从而构象锁定酶，这一概念不同于单纯的包埋。研究人员随后展示了SFPA平台在模块化酶固定化方面的卓越酶学稳定性、底物通用性和形态可编程性。合理的酶选择可赋予先进的生物功能，包括仿生矿化、抗氧化防御和抗菌活性。值得注意的是，将级联酶区室化于酸敏感性核-壳纳米颗粒中可实现门控、刺激响应性催化，而在导电载体上的空间分离则促进了酶介导的电荷转移以实现局部电化学腐蚀控制。重要的是，这些生物界面组装体促进了细胞粘附，并在小鼠皮下植入模型中表现出强效的抗炎和抗感染功效，预示了良好的生物应用前景。

在分子相互作用研究方面，研究人员通过分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟揭示了PA与SF的相互作用机制。模拟结果显示，质子化的PAH与SF之间表现出显著更负的总能量和库仑能量，表明质子化增强了PA与SF之间的静电吸引，这是SF-PAH复合物稳定性增强的主要贡献因素。对应的均方根偏差（root-mean-square deviation, RMSD）分析显示，SF-PAH系统中蛋白主链更快达到稳定平台，进一步证实了其优越的构象稳定性。氢键分析表明，两种系统中氢键数量相似，质子化带来的稳定性提升并非主要通过增加氢键数量实现，而是源于带正电荷的PAH与SF表面负电荷区域之间增强的净静电互补性。结构可视化显示，在PAH存在下，SF链采取更紧凑的构象，形成了中空空间，表明质子化的PA能够作为分子交联剂与SF的多个链段结合，压缩蛋白结构。二级结构监测显示，PA有效驱动SF从无规卷曲向有序构象转变，增加了α-螺旋和β-折叠含量，同时减少了无规卷曲比例。

在模型组装体制备方面，研究人员选择钛作为模型基底，因其在生物医学植入物中的广泛应用，而这种金属固有的生物惰性需要表面功能化以实现所需的生物学性能。碱性磷酸酶（ALP）被选为模型酶。通过简单混合SF、PA和ALP于钛表面，PA的粘附性儿茶酚基团和β-折叠构象转变协同促成了高质量、基底粘附的酶固定化涂层的形成。水接触角测量、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared, FTIR）和圆二色谱（circular dichroism, CD）等表征证实了涂层的成功制备和PA诱导的β-折叠富集结构的形成。Amide I带去卷积分析显示，从SF涂层转变为SFPA涂层时，无规卷曲含量从33.87%显著降至10.71%，而β-折叠含量从26.83%显著增至50.48%。核磁共振氢谱（¹H NMR）确认了席夫碱的形成，其亚胺质子信号出现在约8.2 ppm处，且PA的醛基质子信号在SF与PA混合后减少了32.6%，对应席夫碱键密度为8.15×10^?5 mol/g。

在酶学性能评估方面，SFPA平台展现出卓越的稳定性。ALP固定化效率数据显示，Ti-SFPAALP的酶泄漏率（36.7%）显著低于Ti-SFALP（62.2%），表明PA修饰的SF网络具有更优的酶保持能力。在水凝胶基扩散实验中，SFPAALP水凝胶在所有时间点的累积泄漏量均显著低于SF-ALP。热循环稳定性测试中，Ti-SFPAALP在25 °C、37 °C和50 °C下经历20次循环后始终保持最高的残余活性，即使在50 °C的严苛条件下仍保持可感知的活性。长期储存稳定性方面，Ti-SFPAALP样品在室温储存12个月后仍保留47.7%的初始催化活性。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）作为折叠报告子的实验进一步证实，固定化于β-折叠纳米口袋中的GFP在室温孵育24小时后保留了70.9%的初始荧光强度，而游离GFP仅保留4.2%。

底物空间位阻实验表明，β-折叠纳米口袋对底物进入酶活性位点存在空间限制。使用较小底物对硝基苯酚磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate, p-NPP）和较大底物4-甲基伞形酮磷酸酯（4-methylumbelliferyl phosphate, 4-MUP）的比较显示，无论对于Ti-SFALP还是Ti-SFPAALP，较大底物的活性均显著降低，且米氏常数（K_m）从游离ALP的512.18 μmol/L增至Ti-SFPAALP的807.14 μmol/L，与底物可及性降低导致的空域限制效应一致。

PA浓度的优化研究显示酶活性呈现典型的火山型趋势，在125 mM时达到最优，过高浓度反而导致活性下降。FTIR Amide I去卷积分析表明，β-折叠含量随PA浓度增加先升后降，在12.5 mM时达到最高（59.55%），随后在125 mM（58.36%）和250 mM（54.06%）时下降，提示过量PA可能破坏有序的β-折叠形成。

在通用底物粘附和生物亲和性方面，SFPA组装体在聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene, PTFE）、聚醚醚酮（polyetheretherketone, PEEK）、玻璃和硅等多种材料上均形成了连续、粘附的涂层。X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy, XPS）证实了表面化学组成的改变，而水接触角測量显示涂层后表面 converged 至中等亲水性范围（66–75°），表明形成了掩盖原始表面、化学均一的生物界面。划痕测试显示不同基底上的粘附强度存在差异：钛上最高（30.83 N），PTFE次之（17.26 N），玻璃最低（9.98 N）。细胞粘附实验表明，SFPA涂层表面显著增强了MC3T3-E1前成骨细胞的粘附和铺展，表现最优的细胞密度和伪足扩展，resazurin代谢活性检测证实SFPA涂层表面细胞代谢活性显著高于SF涂层和未涂层对照。活/死染色和CCK-8检测确认了SF和SFPA涂层的良好生物相容性。

在形态可编程性和酶/材料通用性方面，通过调节PA浓度和环境湿度，研究人员获得了可完整剥离的自支撑宏观薄膜；通过加入甘油可制备酶负载水凝胶；还可应用于液态金属（liquid metal, LM）微球和MOF纳米颗粒。ALP在不同宏观材料（PEEK、硅、混合纤维素酯膜）上的固定化均表现出SFPAALP > SFALP > 直接吸附ALP的一致性能顺序。GOx、HRP、SOD等不同结构和催化机制的酶在SFPA平台上均表现出与ALP相似的稳定化效果。SFPAGOx系统在3天连续运行中保持显著活性，并对金黄色葡萄球菌（S. aureus）产生明显的抑菌圈。在GaInSn基LM微载体上共固定化GOx和HRP的级联催化微系统成功介导了串联反应，证明了平台对非平面、微观载体的适用性。

在空间程序化级联酶方面，研究人员设计了两种概念验证系统。第一种为核-壳纳米系统：HRP包埋于酸敏感性ZIF-8核心内，GOx整合于SFPA外壳中，通过空间区室化实现门控催化。扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）和透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）证实了层级组装的成功，TEM显示均匀聚合物壳层厚度约65 nm。TMB比色分析验证了区室化催化的可控性：完整核-壳颗粒产生最小信号，表明空间分离成功阻止了HRP与GOx产生的H₂O₂接触；仅在MOF结构部分降解后才检测到显著催化信号。第二种系统为U型导电金属钉装置：GOx和HRP区域性地固定于两端，嵌入葡萄糖琼脂糖凝胶后，完整闭合回路钉的GOx涂层端比切断开路对照更快、更强烈地显色，表明导电基底中的电子流影响了级联反应动力学。进一步使用纯锌丝的实验显示，闭合回路条件下腐蚀被重定向至HRP涂层端，暗示酶生成的微电流调节局部电化学以控制阳极腐蚀位点。

在体内生物相容性和抗炎/抗感染效应方面，研究人员制备了载有SOD/CAT级联酶的SFPA自支撑薄膜进行皮下植入。苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色显示，SFPASOD/CAT组在14天内表现出最显著且持续的炎症衰减。Masson's三色染色和纤维囊厚度测量表明，SFPASOD/CAT薄膜诱导了显著更薄、更有组织的纤维层。转录组学分析显示，与SF组相比，SFPA组减少了促炎基因（IL-1a、IL-1b、Ccl2）的表达；基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）分析揭示了与炎症和组织修复相关的生物学过程和通路的主富集，包括趋化因子信号通路和C型凝集素受体信号通路。基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）显示SFPA组相对于SF组增强了抗炎能力，表现为促炎通路的抑制和mRNA监测通路的激活。

在抗菌评估方面，研究人员将广谱抗菌肽HHC36固定于钛植入物表面。金黄色葡萄球菌污染后的皮下植入实验显示，Ti-SFPAHHC36表面附着的细菌数量急剧减少，许多细菌呈现膜损伤。Giemsa染色和H&E染色证实，Ti-SFPAHHC36植入物周围组织细菌簇极少，炎症细胞浸润显著减少。溶血实验表明，游离HHC36的溶血率为4.08%（接近5%的ISO10993-4阈值），而SFPA固定化HHC36的溶血率降至3.19%，显示改善的血液相容性。

主要器官的组织学检查未发现全身毒性。

研究结论部分指出，富含β-折叠的丝素蛋白-儿茶酚-酶自组装体构成了一个简便、受生物启发的、拼图式设计的平台，协调了酶固定化中至关需要的催化活性保持与界面适应性。所得生物催化结构增强了对恶劣环境（包括高温）的耐受性，并保持了 exceptional 的一年储存稳定性。该平台容纳了多种固体和软质基底，跨越多个尺度，并可形态学编程为涂层、薄膜或水凝胶。合理的酶整合赋予了按需的生物功能，包括仿生矿化、抗氧化防御和抗菌效应。超越简单固定化，级联酶在酸敏感性MOF核-壳纳米颗粒中的空间区域组织实现了门控、刺激响应性催化，而在导电载体上的分离促进了酶介导的电荷转移以指导局部电化学腐蚀。在生物学上，这些组装体引发了通用细胞粘附，并在体外/体内表现出良好的生物相容性和抗感染/抗炎特性。该研究为先进非均相生物催化提供了一个多功能的生物活性蓝图，潜在应用范围从植入物涂层和伤口敷料到可持续制造和智能生物传感器。SF固有的构象可编程性以及儿茶酚的结构多样性和化学反应性使这种拼图式策略能够适应各种材料配方，并可readily外推至其他生物分子的固定化，包括肽类、生长因子和抗生素，用于活性保持或控释。尽管前景广阔，仍需在病理条件下（如pH波动、蛋白酶活性、免疫细胞浸润）进一步评估，这些因素可能影响涂层稳定性和长期酶活性，同时需要系统评估降解产物的生物分布、免疫原性以及长期生物安全性和有效性，这些对于临床转化至关重要。