《Contact Lens and Anterior Eye》：Diagnostic utility of inflammation-associated clinical signs in detecting MMP-9 expression in dry eye disease: A cross-sectional conjunctival impression cytology and droplet digital PCR study
编辑推荐：
目的：目前用于检测干眼症（DED）眼表炎症的临床检测手段其实用性大多尚未被探究。本横断面研究旨在探讨临床检查指标与眼表炎症分子生物标志物之间的关系，以确定其诊断价值。方法：研究人员对干眼症患者及非干眼受试者评估了球结膜充血（主观及客观分级）、InflammaD
目的：目前用于检测干眼症（DED）眼表炎症的临床检测手段其实用性大多尚未被探究。本横断面研究旨在探讨临床检查指标与眼表炎症分子生物标志物之间的关系，以确定其诊断价值。方法：研究人员对干眼症患者及非干眼受试者评估了球结膜充血（主观及客观分级）、InflammaDry? MMP-9试纸、眼表炎症评估评分（Ocular Surface Inflammation Evaluation?，OSIE?；Tearcheck?系统）及眼表染色情况，并采集结膜印迹细胞学（conjunctival impression cytology，CIC）标本进行微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）以定量基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）及白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的基因表达水平，通过受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC曲线）确定各临床检测识别生物标志物升高的诊断效能及最佳临界值。结果：共纳入47例受试者（年龄55 ± 18岁；男性占21%），其中79%符合TFOS DEWS II干眼诊断标准，84%为脂质缺乏型。可检测到MMP-9 mRNA表达与以下指标显著相关（均p < 0.05）：非侵入性泪膜破裂时间（non-invasive tear film breakup time，NIBUT）< 5.8 s、球结膜充血评分（JENVIS > 1.0 或 Efron分级 > 1.5）、InflammaDry阳性、干眼症状问卷阳性（DEQ-5 > 9 或 OSDI > 33.3）及较薄的泪膜脂质层等级（lipid layer grade，LLG ≤ 2）。IL-8及IL-1β水平与各临床指标无显著关联。若球结膜充血（JENVIS法）、NIBUT及LLG三项中至少有两项异常，则在样本内诊断可检测MMP-9表达的敏感度为78.6%，特异度为78.8%。结论：由球结膜充血（JENVIS > 1.0）、泪膜不稳定（NIBUT < 5.8 s）及脂质不足（LLG ≤ 2）组成的检测组合，可较优地识别出存在可检测MMP-9表达的个体。两项及以上临床体征阳性可帮助筛选高风险人群；虽仍需进一步验证，但结果表明炎症标志物的检出可能仅限于干眼症状与体征评分较高的患者。
本研究发表于《Contact Lens and Anterior Eye》。
一、研究背景与立题依据
干眼症（dry eye disease，DED）是一种多因素眼表疾病，其特征为泪膜稳态失衡并伴有泪膜不稳定、高渗及眼表炎症等病理改变。目前临床上常用球结膜充血分级、InflammaDry?等点-of-care检测评估眼表炎症，但这些炎症相关临床体征对分子水平炎症生物标志物检测效用的验证十分有限。基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）和白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）是与DED相关的眼表炎症介质，其中MMP-9被认为可破坏上皮紧密连接蛋白并放大炎症级联反应。然而，临床常用炎症评估手段是否能反映结膜组织实际的炎症基因表达尚不清楚。此外，不同DED亚型（尤其是常见的脂质缺乏型伴睑板腺功能障碍meibomian gland dysfunction，MGD）炎症反应相对"低幅度（muted）"，使得炎症检测更加困难。因此，Catherine J. Jennings、Alex Muntz、Michael T.M. Wang、Salim Ismail、James S. Wolffsohn及Jennifer P. Craig等研究人员开展此项横断面研究，以明确常规临床炎症相关体征与结膜印迹细胞学经微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）测得的MMP-9、IL-8、IL-1β mRNA表达之间的关联，从而评估各临床检测识别结膜MMP-9表达的诊断价值，为临床筛查存在炎性活动的DED患者提供依据。
二、主要研究方法概述
研究人员在新西兰奥克兰大学开展单中心横断面研究，经奥克兰健康研究伦理委员会批准（AHREC 22183），招募≥18岁、有或无DED症状的受试者，排除近3个月眼部手术史、泪小点栓植入及使用促炎药物者，检查前48小时停用滴眼液、热敷及角膜接触镜。DED诊断及亚型分类遵循TFOS DEWS II诊断标准。按顺序行临床检测：Keratograph 5M测定泪河高度（tear meniscus height，TMH）、非侵入性泪膜破裂时间（non-invasive tear film breakup time，NIBUT）、泪膜脂质层等级（lipid layer grade，LLG，改良Keeler-Guillon 0–6级）及客观球结膜充血（JENVIS 0–4分）；TearLab?测双眼泪液渗透压；裂隙灯下行主观球结膜充血Efron 0–4分级、睑板腺可挤出性及分泌物质量Greiner分级、红外睑板腺照相Pult meiboscale分级、荧光素与丽丝胺绿眼表染色Oxford分级、睑缘擦拭上皮病变Korb分级；Tearcheck?测眼表炎症评估（Ocular Surface Inflammation Evaluation，OSIE?）；InflammaDry?检测泪液MMP-9蛋白（阈值>40 ng/mL）；表面麻醉后行上方颞侧球结膜印迹细胞学（conjunctival impression cytology，CIC，EYEPRIM?），标本冻存于TRIzol?，提取RNA逆转录为cDNA，采用ddPCR（Bio-Rad QX200）定量MMP-9、IL-8、IL-1β及7个内参基因表达，NormFinder选定最稳定内参计算标准化表达量。统计学上行ROC曲线分析确定最佳临界值，多元Logistic回归构建组合模型，探索性制定"异常项数"临床决策规则，以p<0.05为差异有统计学意义。
三、研究结果
- 3.
结果（Results）
共47例完成全部检查及实验室分析，平均年龄55±18岁，女37例（79%）；79%（37/47）符合TFOS DEWS II DED诊断，其中84%（31/37）为脂质缺乏型蒸发过强型DED，仅1例为单纯水液缺乏型，5例混合型。ddPCR检测显示MMP-9转录本阳性14例（30%），IL-8阳性24例（51%），IL-1β阳性23例（49%）。
3.1. 干眼诊断与稳态/亚型指标作为MMP-9、IL-8、IL-1β预测因子的诊断评估参数（Association between key clinical diagnostic dry eye markers and the presence of laboratory inflammatory biomarkers）
研究人员通过ROC分析发现，NIBUT预测MMP-9可检测性的AUC为0.747（p=0.002），最佳临界值≤5.8 s；症状问卷DEQ-5＞9（AUC=0.688，p=0.021）和OSDI＞33.3（AUC=0.680，p=0.028）亦具预测价值；LLG≤2预测MMP-9的AUC为0.685（p=0.033）；TFOS DEWS II DED诊断本身与MMP-9阳性相关（AUC=0.652，p＜0.001）。泪河高度（TMH）、泪液渗透压及其眼间差值与MMP-9无显著关联。IL-8及IL-1β表达与所有临床干眼诊断及稳态指标均无显著关联（均p＞0.05）。
3.2. 炎症评估检测作为MMP-9、IL-8和IL-1β的预测因子（Inflammation assessment tests as predictors of MMP-9, IL-8 and IL-1β）
客观球结膜充血JENVIS＞1.0预测MMP-9的AUC=0.747（p=0.002，敏感度86%，特异度64%），主观Efron＞1.5的AUC=0.688（p=0.029）；InflammaDry阳性预测MMP-9的AUC=0.699（p=0.006），但与ddPCR MMP-9转录本一致性较低（5例二者均阳性，9例ddPCR阳性而InflammaDry阴性，19例InflammaDry阳性而ddPCR阴性，14例均阴性）。OSIE?及Oxford染色分级与MMP-9无显著关联。IL-8和IL-1β同样不与任一炎症临床检测显著相关（均p＞0.05）。
3.3. 检测组合的诊断性能（Diagnostic performance of test combinations）
多元Logistic回归显示，含客观球结膜充血（JENVIS＞1.0）+LLG≤2+NIBUT＜5.8 s三指标组合的模型拟合最优（AIC=49.0，AUC=0.842，95%CI 0.708–0.976）。探索性临床决策规则显示：三项指标中任意≥1项异常——敏感度92.9%但特异度仅36.4%；≥2项异常——敏感度78.6%、特异度78.8%、阳性预测值61.1%、阴性预测值89.7%；≥3项异常——特异度升至97.0%但敏感度降至35.7%。提示两项及以上异常可较好筛查MMP-9转录本可检测人群。
四、讨论与结论总结
讨论部分指出，本研究人群中多为轻中度脂质缺乏型DED，仅球结膜充血（主客观）、NIBUT缩短及LLG降低与结膜MMP-9 mRNA检出相关，且所需临界值较常规DED诊断阈值更严格（NIBUT≤5.8 s vs 常用10 s；DEQ-5＞9、OSDI＞33.3 vs 常规≥6和≥13），提示MMP-9表达多出现于体征与症状偏重的患者，印证脂质缺乏型DED炎症应答较"低幅度"。InflammaDry因设定40 ng/mL阈值，对轻度升高MMP-9不够敏感，与ddPCR（检测结膜组织mRNA）属不同层面测量，故一致性有限。OSIE?低特异度提示其综合评分反映广泛眼表改变而非特指MMP-9阳性。IL-8、IL-1β未与临床参数相关，可能与脂质缺乏型DED炎症呈波动、瞬态低水平表达，且IL-1β处上游级联、本研究为横断面设计未能捕捉时序变化有关；此外IL-8在干燥综合征相关水液缺乏型DED中升高更典型，与本队列亚型分布不符。研究局限性包括缺乏公认金标准炎症标志物、MMP-9为非DED特异性、MMP-9阳性例数较少致决策规则需外部独立队列验证、未进行bootstrap内部验证等。该研究的意义在于证明常规非侵入性临床体征组合可用于识别潜在存在结膜MMP-9表达（即具炎症活动）的DED患者，为抗炎治疗决策提供参考框架。
结论（Conclusions）翻译：
在以此项研究中以睑板腺功能障碍相关DED为主的队列中，联合非侵入性球结膜充血评估、泪膜稳定性及脂质层等级的检测方案，对识别结膜MMP-9转录本信号具有最佳预测效用。炎症标志物检出与干眼严重程度相关；MMP-9表达阳性者表现出更高的症状评分及更明显的临床体征，这进一步支持轻中度脂质缺乏型（常见于睑板腺功能障碍）DED中炎症反应较为低幅度的观点。
