《Differentiation》：Validated CRISPR/Cas9 guide RNAs targeting neurodevelopmental genes in the tunicate Ciona robusta
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玻璃海鞘（Ciona robusta）为解析发育与细胞生物学的遗传调控提供了强有力且简化的模式系统。其幼体中枢神经系统（CNS）仅由200余个神经元和感觉细胞构成，因此也成为神经生物学及神经系统发育研究的模式生物。尽管CRISPR/Cas9介导的诱变技术现已在
玻璃海鞘（Ciona robusta）为解析发育与细胞生物学的遗传调控提供了强有力且简化的模式系统。其幼体中枢神经系统（CNS）仅由200余个神经元和感觉细胞构成，因此也成为神经生物学及神经系统发育研究的模式生物。尽管CRISPR/Cas9介导的诱变技术现已在玻璃海鞘中常规应用，成为探究多种生物学过程中基因功能的重要技术手段，但针对若干关键神经基因的经实验验证的单链向导RNA（single-guide RNAs, sgRNAs）尚待验证。本研究报告了25条新型sgRNAs的设计与实验验证，这些sgRNAs靶向8个保守基因，这些基因编码参与神经发育与神经功能的保守蛋白质，包括6个转录因子（Cdx、Foxb、Sox1/2/3、Dmbx、Engrailed和Mnx）以及2个神经效应基因（Tyrosinase和Slc18a3/VAChT）。候选sgRNAs经筛选后，通过基于Illumina的目标位点扩增子测序检测其诱变效率。所有sgRNAs均在其靶位点诱导了插入或缺失突变，大多数基因至少产生一条突变效率超过30%的sgRNA，唯Dmbx基因的最大突变效率仅达25%。研究人员进一步将实测突变效率与不同预测算法生成的评分进行比较，发现与基于较新算法的预测存在中等程度的改善相关性。基于这些结果，研究人员建议联合考虑两种评分算法，以提高对玻璃海鞘CRISPR实验的预测价值。
## 研究背景与问题
中枢神经系统的发育依赖于基因在精确时空维度上的转录调控，这些基因控制神经前体细胞分化为不同功能的神经元亚型。玻璃海鞘（Ciona robusta）作为被囊动物的代表，因其极度简化的中枢神经系统——幼体CNS仅由200余个神经元和感觉细胞构成——而成为研究神经系统发育的理想模式生物。与海鞘类其他物种相似，玻璃海鞘具有双相生命周期，从自由游泳的幼体变态为固着成体。其游泳行为由少数中枢神经系统细胞组成的运动神经节和尾部神经索直接调控，其中部分结构可能与脊椎动物的后脑和脊髓同源。游泳行为使幼体能够识别适宜的硬质基质以附着并启动变态，而附着后的变态过程可通过机械感觉 cues 触发。
尽管被囊动物作为细胞、发育和整体生物学研究的模式生物已有超过百年历史，但分子技术手段应用于玻璃海鞘中枢神经系统的研究则是近年的进展。CRISPR/Cas9技术现已成为玻璃海鞘及其他被囊动物中研究基因功能的常规工具。近期研究改进了用于组织特异性CRISPR/Cas9介导诱变的单链向导RNA（sgRNA）的设计与验证实验流程，为本研究奠定了基础。
### 研究目的
本研究旨在利用改进的sgRNA设计和验证方法，为玻璃海鞘幼体中枢神经系统中表达的神经发育关键基因设计并验证新型sgRNAs。这些靶基因涵盖多种保守的神经发育转录调控因子，以及两个保守的感觉/神经细胞功能效应分子。其中多数基因此前尚未在玻璃海鞘中通过CRISPR/Cas9进行敲除研究。研究人员期望这些试剂能够免费向玻璃海鞘研究社区提供，以促进对幼体神经系统的深入研究。
## 主要技术方法
本研究采用以下关键技术路线：通过在线工具CRISPOR进行sgRNA候选序列筛选；构建包含U6小RNA启动子的sgRNA表达质粒，采用寡核苷酸亚克隆、PCR亚克隆或基于de novo基因合成与定制克隆服务（Twist Bioscience）的新方法；通过商业化Illumina平台target site amplicon测序服务（Genewiz公司的Amplicon-EZ）进行诱变效率检测；采用pigmentation assay进行Tyrosinase sgRNA的功能验证；运用Pearson相关性分析比较预测算法与实测突变效率的关系。
## 研究结果
**靶基因选择与sgRNA设计**
研究人员选择了6个转录因子基因，这些基因在玻璃海鞘发育过程中具有明确记录的表达模式，包括早期表达调控因子（Cdx、Foxb、Sox1/2/3）和较晚表达的调控因子（Dmbx、Engrailed、Mnx）。此外，设计了靶向Tyrosinase（Tyr）基因的sgRNA，该基因编码黑色素生物合成的限速酶，在幼体感光和感地器官相关的色素细胞中表达。同时设计了靶向Slc18a3（通常称为囊泡乙酰胆碱转运蛋白，VAChT）的sgRNA，该基因属于高度保守的"胆碱能基因座"，与胆碱乙酰转移酶（ChAT）共享第一个外显子。
**sgRNA诱变效率的扩增子测序验证**
通过Amplicon-EZ测序检测到所有25条测试sgRNAs在靶位点均产生插入缺失（indels）突变，突变效率存在差异。除Dmbx外，所有基因均至少有一条sgRNA的效率超过30%。尽管设计了5条靶向Dmbx的sgRNA，最高效率仅达25%，这可能与其极小的外显子尺寸及高评分候选sgRNA匮乏有关。
**Tyrosinase sgRNA的功能验证**
为进一步验证Tyr sgRNA的效力，研究人员进行了简单的色素沉着检测。将靶向不同外显子的sgRNA 1.185和5.16联合使用，与Sox1/2/3>Cas9::Geminin
Nterminus共电转，以特异性敲除外胚层来源的色素细胞中的Tyr。结果显示，与对照组相比，CRISPR处理组幼体出现零个或仅一个色素细胞的频率显著增加，约50%的色素细胞减少率与扩增子测序测得的sgRNA效率相符。
**预测算法比较分析**
CRISPOR近期引入了更新的Doench '16算法"Doench Ruleset 3"（RS3）。研究人员重新评估了预测算法与实际突变效率的相关性，发现在该数据集中预测评分与实测突变效率存在中等程度相关性，RS3算法的Pearson相关系数略高。将两种Doench评分标准化后取平均（"Doench Norm+Ave"）时相关性略高。
## 讨论与结论
本研究设计并测试了25条靶向玻璃海鞘8个不同神经发育基因的新型sgRNA表达质粒。研究结果表明，所有测试sgRNAs均能有效诱导靶位点突变，验证了这些试剂在玻璃海鞘神经发育研究中的可用性。对于Dmbx基因效率受限的情况，研究人员指出这可能与其基因结构特性相关。
在预测算法比较方面，研究提示新型Doench Ruleset 3算法可能具有更优的预测价值，但由于当前分析的sgRNAs最初是基于高Doench '16评分筛选的，未来需要采用无偏倚的预测sgRNA集合进行更全面的算法比较。
研究人员将这些质粒立即发布并共享给玻璃海鞘研究社区，同时提供Twist Biosynthesis平台上的机载sgRNA和Cas9表达质粒 access，以便于新sgRNA和Cas9载体的定制合成与克隆。
**研究结论**：本研究已设计并测试了靶向模型被囊动物玻璃海鞘8个神经发育基因的新型sgRNA表达质粒，并立即发布共享以促进更广泛的玻璃海鞘研究社区的应用。预测与实际indel效率的比较表明，CRISPOR在线预测工具中的新型"Doench Ruleset 3"评分可能是选择玻璃海鞘CRISPR实验新sgRNAs时优先考虑的算法，但目前研究人员仍建议选择在两种算法中评分均较高的sgRNAs。
