《European Journal of Internal Medicine》：Recurrent t(9;12) translocation disrupting ACVRL1 intron 9 causes hereditary haemorrhagic telangiectasia missed by standard exome sequencing in four unrelated families
编辑推荐：
背景：遗传性出血性毛细血管扩张症（Hereditary haemorrhagic telangiectasia, HHT）是一种常染色体显性血管疾病，最常见由ACVRL1或ENG基因的致病性变异引起。大多数致病性变异为编码区错义、无义、剪接位点变异或小片段插入
背景：遗传性出血性毛细血管扩张症（Hereditary haemorrhagic telangiectasia, HHT）是一种常染色体显性血管疾病，最常见由ACVRL1或ENG基因的致病性变异引起。大多数致病性变异为编码区错义、无义、剪接位点变异或小片段插入/缺失及外显子水平缺失/重复，通常可被下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）检出。然而，平衡结构重排及深内含子变异无法被标准基于全外显子测序（Whole Exome Sequencing, WES）的方法可靠检测，可能是遗传学未明病例的病因。
方法：研究人员调查了四例临床符合HHT但既往WES无阳性发现的无关家系。所有受累个体有反复自然流产史，进一步临床回顾发现曾行核型分析。上述细胞遗传学发现促使研究人员对WES数据重新分析以评估HHT相关基因是否被破坏。
结果：四例家系均携带表型平衡的t(9;12)(p21.2;q13.13)易位。断点定位显示该易位破坏ACVRL1基因第9内含子内一个CT富集区——已知突变热点。WES数据再分析支持ACVRL1被破坏为可能的致病机制。该易位在所有家系中与疾病共分离，未见于未受累亲属。所有携带者满足HHT临床诊断标准。反复自然流产史成为提示进行细胞遗传学检查并实现分子诊断的关键临床线索。
结论：研究人员鉴定出一种反复发生的t(9;12)(p21.2;q13.13)易位，其破坏ACVRL1第9内含子且标准外显子组方法无法检出，是遗传学未明HHT患者中此前未被认识的一种病因。本研究强调并支持对未解决的HHT病例应扩展基因组检测范围，超越常规全外显子测序。
论文解读
研究背景与立题依据
遗传性出血性毛细血管扩张症（Hereditary haemorrhagic telangiectasia, HHT；又名Rendu-Osler-Weber病，MIM #187300）是一种罕见的常染色体显性遗传性血管疾病，以皮肤黏膜毛细血管扩张及内脏动静脉畸形（Arteriovenous Malformation, AVM）为主要特征，常见累及肺、肝、脑及胃肠道。临床诊断采用Cura?ao标准（反复鼻出血、皮肤黏膜毛细血管扩张、内脏AVM、一级亲属患病≥3项）。约80%–85%的基因确诊HHT病例由骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein, BMP）9/10–ENG–ALK1–SMAD信号通路中ACVRL1（编码ALK1）或ENG（编码Endoglin）基因的致病性变异所致，以编码区错义、无义、移码及外显子水平拷贝数变异（Copy Number Variation, CNV）为主，可通过靶向基因panel或全外显子测序（Whole Exome Sequencing, WES）检出。然而仍有15%–20%临床确诊HHT患者经标准NGS未能发现致病变异。已有研究表明深内含子变异（如ACVRL1第9内含子产生隐蔽外显子/cryptic exon）、启动子/5′UTR调控变异及平衡结构重排（如破坏ENG的倒位）可能是"基因型阴性"HHT的原因，而此类非编码区和结构变异不在常规WES分析流程检测范围内，构成诊断盲区。本文即针对四例WES阴性的临床确诊HHT无关家系，因反复流产史提示行核型分析发现相同平衡易位，进而探讨其是否为ACVRL1非编码区破坏导致的HHT新致病机制。该论文发表于《European Journal of Internal Medicine》。
主要技术方法与研究对象
研究人员纳入来自Bellvitge大学医院HHT单元（其中一家系联合Clínic de Barcelona肺畸形单元）的四例无关先证者，均符合Cura?ao标准≥3条且WES初筛HHT相关基因（ACVRL1、ENG、SMAD4、BMPR2、GDF2、EPHB4、PIK3CA、RASA1、SMAD6、TEK）无阳性发现。主要方法包括：(1)常规G显带核型分析；(2)WES建库（Illumina DNA Prep with Exome 2.5 Plus Enrichment，2×100 bp或2×150 bp测序，平均深度~110×），比对GRCh37/hg19，用Data Genomics Software及VarSeq行SNV/Indel与CNV分析，Emedgene行表型驱动分析；(3)WES数据再分析——用GATK HaplotypeCaller行变异识别，GRIDSS v2.13.2检测结构变异（Structural Variant, SV），Integrative Genomics Viewer（IGV）可视化分裂读段（split reads）与不一致读对（discordant read pairs）；(4)断点PCR扩增及Sanger测序验证易位连接区；(5)家系共分离分析——核型筛查结合PCR-Sanger验证。
研究结果
3.1. Clinical overview of the cohort（研究队列的临床概况）
四例先证者（三家女性，一家男性，51–70岁）均满足Cura?ao 4/4条标准，具长期反复鼻出血、皮肤黏膜毛细血管扩张及肝脏血管受累（毛细血管扩张/AVM/分流），部分伴肺AVM（已栓塞）。均报告有反复自然流产史（2–3次），因此曾行核型分析。三家明确报告t(9;12)(p21.2;q13.13)，第四家系病史提示同类改变。初查WES及aCGH均无HHT相关编码区变异或CNV，提示可能存在非编码区/结构变异病因。
3.2. WES reanalysis reveals disruption of ACVRL1 intron 9（WES再分析揭示ACVRL1第9内含子被破坏）
受核型结果提示，研究人员重点检视WES数据中ACVRL1（12q13.13）覆盖情况。断点定位示易位断裂点位于ACVRL1第9内含子内c.1378–136（chr12:52,314,407, hg19），与9号染色体9p21.2处REXO6P（又称LINC00032）假基因内含子区（chr9:27,263,901）相连。GRIDSS检出该易位，IGV可见典型split reads与discordant pairs支持。该易位造成ACVRL1自第9内含子至第10外显子部分序列缺失[c.(1378–136(1512?)del]，按ACMG/AMP标准评为致病性（PVS1_strong, PS4, PM2_Supporting, PP1_strong）。ACVRL1第9内含子为已知CT富集突变热点，该区域破坏预计影响正常剪接致基因功能丧失（haploinsufficiency），符合HHT经典致病机制。
3.3. Segregation with disease（与疾病共分离验证）
通过核型筛查联合断点PCR–Sanger测序，在所有可评估家系中t(9;12)(p21.2;q13.13)与HHT表型完全共分离——检出者为所有患病成员，未检出者为未患病亲属，证实该平衡易位为家系中HHT的致病原因。
讨论与结论总结
本研究于四例无关HHT家系中发现并证实一种反复发生的表观平衡易位t(9;12)(p21.2;q13.13)，其断裂点精确破坏ACVRL1第9内含子（已知突变热点），属标准WES及aCGH无法检出的平衡结构重排破坏非编码区的新型HHT致病机制，拓展了HHT突变谱。研究指出常规WES流程不能可靠捕获深内含子断点的平衡易位及深内含子/调控区变异，是部分HHT基因型未明的原因；aCGH亦无法识别无拷贝数改变的平衡易位。四家系共有反复自然流产史，在HHT本身无此特异性关联背景下，更可能源于平衡易位携带者减数分裂不平衡分离致胚胎染色体异常，是提示临床开展核型分析的重要线索。研究者建议对临床确诊但基因未明的HHT患者应详细采集生殖史（尤其反复流产），回顾既往细胞遗传学资料，必要时加做核型或结构变异分析（如光学图谱/Bionano、长读长WGS或WES SV再分析），并对既往阴性数据进行周期性再评估。综上，研究人员得出结论：反复发生的t(9;12)(p21.2;q13.13)易位破坏ACVRL1内含子9是遗传性出血性毛细血管扩张症在标准全外显子测序中漏诊的新致病原因；对于未解决HHT病例应采取整合临床评估、细胞遗传学与迭代基因组再分析的扩展诊断策略，关注非编码区及结构变异的贡献。
