肠道微生物群与子宫腺肌病的因果关系：宏基因组测序与孟德尔随机化

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Causal relationship between gut microbiota and adenomyosis: metagenomics sequencing and Mendelian randomization

背景：越来越多的证据表明肠道微生物群（gut microbiota, GM）参与子宫腺肌病（adenomyosis, AM）的发病机制；然而，这种关联是否具有因果性以及其作用机制尚不明确。方法：为探究潜在的因果关联，研究人员采用双样本孟德尔随机化（two-sample Mendelian randomization, MR）分析，以逆方差加权法（inverse-variance weighting, IVW）为主要估计方法，辅以MR-Egger、加权中位数和加权模式法，评估肠道微生物分类群和微生物来源的代谢通路对AM的因果效应。研究人员进一步开展中介分析，以阐明循环免疫细胞表型在该过程中的作用。同时，在一个独立的临床队列中，研究人员严格按照纳入和排除标准（包括抗生素使用史和长期本地居住要求），从所在机构的健康体检中心招募了22例AM患者和23例年龄匹配的健康对照，进行鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomic sequencing）。AM组与对照组之间的细菌群落类型存在显著差异。随后，研究人员采用线性判别分析效应量（Linear Discriminant Analysis Effect Size, LEfSe）方法将结果与MR研究进行交叉比较，并进一步采用ANCOM-BC方法进行验证，以确定共同的微生物特征。结果：MR分析鉴定出10个微生物分类群和10个代谢通路与AM存在潜在的因果关联。其中，9个分类群和5个通路与AM风险降低相关，包括模糊另普雷沃菌（Alistipes indistinctus, OR=0.847, 95% CI=0.754–0.951, p=0.005）、扭链瘤胃球菌（Ruminococcus torques, OR=0.818, 95% CI=0.712–0.941, p=0.005）、δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria, OR=0.780, 95% CI=0.629–0.967, p=0.024）、脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae, OR=0.780, 95% CI=0.629–0.967, p=0.024）、脱硫弧菌目（Desulfovibrionales, OR=0.780, 95% CI=0.629–0.967, p=0.024）、人粪副萨特菌（Parasutterella excrementihominis, OR=0.875, 95% CI=0.784–0.977, p=0.017）、布氏瘤胃球菌（Ruminococcus bromii, OR=0.836, 95% CI=0.718–0.972, p=0.020）、芬戈尔德杆菌（Bacteroides finegoldii, OR=0.919, 95% CI=0.855–0.987, p=0.020）和副萨特菌属（Parasutterella, OR=0.886, 95% CI=0.797–0.986, p=0.026）；5个保护性通路包括dTDP-L-鼠李糖生物合成（dTDP-L-rhamnose biosynthesis, OR=0.819, 95% CI=0.674–0.995, p=0.045）、乳糖和半乳糖降解（lactose and galactose degradation, OR=0.818, 95% CI=0.689–0.972, p=0.022）、还原型三羧酸循环（reductive TCA cycle, OR=0.919, 95% CI=0.851–0.993, p=0.032）、尿囊素降解为乙醛酸（allantoin degradation to glyoxylate, OR=0.907, 95% CI=0.830–0.991, p=0.030）和糖酵解I（从葡萄糖-6-磷酸开始）（glycolysis I from glucose-6-phosphate, OR=0.850, 95% CI=0.747–0.967, p=0.013）。相反，1个分类群和5个通路与AM风险增加相关：乳杆菌属（Lactobacillus, OR=1.083, 95% CI=1.008–1.164, p=0.030）、葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸降解（degradation of glucose and glucose-1-phosphate, OR=1.202, 95% CI=1.056–1.369, p=0.005）、粪肠球菌肽聚糖生物合成（peptidoglycan biosynthesis in Enterococcus faecium, OR=1.138, 95% CI=1.007–1.285, p=0.039）、丙酮酸发酵为丙酮（pyruvate fermentation to acetone, OR=1.118, 95% CI=1.001–1.248, p=0.048）、甘油降解为丁醇（glycerol degradation to butanol, OR=1.118, 95% CI=1.011–1.237, p=0.031）和从头嘧啶脱氧核糖核苷酸生物合成（de novo pyrimidine deoxyribonucleotide biosynthesis, OR=1.216, 95% CI=1.063–1.390, p=0.004）。中介分析揭示，免疫细胞表型"CD24⁺CD27⁺ B细胞上的CD24"介导了从布氏瘤胃球菌到AM的通路，占总效应的32.91%（p=0.020）。临床队列的鸟枪法宏基因组分析显示，AM组与对照组之间的α多样性或β多样性无显著差异。在门水平上，AM组中脱硫杆菌门（Desulfobacterota）的相对丰度显著降低（p<0.05）；在属水平上，另普雷沃菌属（Alistipes）同样减少（p<0.05）。LEfSe分析进一步表明AM组中埃希菌属（Escherichia）和梭菌属（Clostridium）富集，而对照组中脱硫杆菌门和理研菌科（Rikenellaceae）富集。将上述结果与孟德尔随机化结果进行匹配，发现脱硫弧菌目和脱硫弧菌科为共享的微生物分类群，该发现随后通过ANCOM-BC方法重新验证并确认。结论：本研究整合遗传因果推断与临床宏基因组验证，为特定肠道微生物分类群、其相关代谢通路以及免疫细胞介导的机制可能因果参与AM的发生发展提供了趋同证据，为未来针对微生物群的AM预防和治疗策略提供了框架。

该研究发表于《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》，聚焦子宫腺肌病（adenomyosis, AM）与肠道微生物群（gut microbiota, GM）之间的因果关系及其潜在机制。AM是一种常见的妇科良性疾病，以子宫内膜腺体和间质侵入子宫肌层为特征，临床表现包括异常子宫出血、盆腔疼痛和不孕，在行子宫切除术女性中患病率高达20%至34%。其发病机制涉及子宫内膜-肌层交界处的组织侵袭、损伤修复反应、局部炎症放大、雌激素水平升高、缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)激活以及核因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB)/转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)通路激活等。此外，子宫内膜干细胞化生、Müllerian管残余物化生以及KRAS突变克隆的侵袭性增殖等机制也被提出。目前AM治疗以子宫切除术为主，药物治疗选择有限，因此识别新的危险因素和开发创新防治策略至关重要。近年来，肠道-子宫轴（gut-uterus axis）和肠道-阴道轴（gut-vagina axis）概念逐渐兴起，肠道微生物群与雌激素依赖性妇科疾病的关系受到关注，但既往研究缺乏对肠道微生物群与AM之间因果关系的系统评估，且大型多中心临床数据不足、微生物组成功能与功能活性表征不充分等问题制约了该领域的深入理解。基于此，研究人员开展了一项整合孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）分析与临床宏基因组验证的研究，旨在推断肠道微生物群与AM之间的因果联系，并探索免疫细胞表型是否介导这一关联。

该研究的双样本MR分析利用荷兰微生物组项目（Netherlands Microbiome Project）的7588例欧洲裔个体的全基因组关联研究（genome-wide association study, GWAS）数据作为肠道微生物群的遗传数据来源，该数据集涵盖177个分类层级分类单元和205个功能通路；AM的遗传数据来自FinnGen项目的5130例病例和119468例对照。工具变量筛选采用p<1×10^-5的宽松阈值，经连锁不平衡聚集分析（r2=0.001, kb=10000）和F统计量>10的质量控制后进行分析。MR采用IVW法作为主要估计方法，辅以MR-Egger、加权中位数和加权模式法，并进行双向MR以评估反向因果，同时采用MR-PRESSO和Cochran's Q检验评估水平多效性和异质性。中介分析采用单变量MR量化暴露对中介的影响（β₁），多变量MR确定中介对结局的独立效应（β₂），间接效应为β₁×β₂。在临床验证部分，研究人员于2024年1月至12月从遵义医科大学第三附属医院招募了22例孤立性AM或腺肌瘤患者及23例健康对照，严格按照加拿大妇产科医师学会（Society of Obstetricians and Gynaecologists of Canada, SOGC）2023年标准诊断，经超声或MRI术前诊断并由术后病理确诊，所有受试者均有至少6个月的本地居住史，并排除了胃肠道疾病、合并雌激素相关妇科疾病、恶性肿瘤、内分泌紊乱、抗生素或益生菌使用史等情况。粪便样本经DNA提取、文库构建后，在DNBSEQ-G400T10平台上采用联合探针锚定聚合测序技术（combined probe-anchored polymerization sequencing, cPAS）进行150 bp双端测序，使用Kraken 2和Bracken进行物种注释，基于统一人类胃肠道基因组（Unified Human Gastrointestinal Genome, UHGG）数据库，采用Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数评估α多样性，Bray-Curtis距离和Jensen-Shannon散度评估β多样性，LEfSe方法鉴定生物标志物，ANCOM-BC方法验证差异分类群。

研究结果部分，"肠道微生物群与AM的遗传因果性"显示，IVW法鉴定出12个与AM显著相关的肠道微生物分类群，其中9个为保护性因素包括模糊另普雷沃菌、扭链瘤胃球菌、δ-变形菌纲、脱硫弧菌科、脱硫弧菌目、人粪副萨特菌、布氏瘤胃球菌、芬戈尔德杆菌和副萨特菌属；3个为风险因素包括拟杆菌目（Bacteroidales）、乳杆菌属和拟杆菌门（Bacteroidetes），但后两者在双向MR中显示反向因果证据而被排除。敏感性分析显示无显著多效性或异质性。"肠道微生物群代谢通路与AM的遗传因果性"部分，IVW法鉴定出11个显著关联的代谢通路，5个保护性通路为dTDP-L-鼠李糖生物合成、乳糖和半乳糖降解、还原型TCA循环、尿囊素降解为乙醛酸以及糖酵解I；6个风险通路为葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸降解、CDP-二酰甘油生物合成（因反向因果被排除）、粪肠球菌肽聚糖生物合成、丙酮酸发酵为丙酮、甘油降解为丁醇和从头嘧啶脱氧核糖核苷酸生物合成。质量控制显示无多效性或异质性证据。"免疫细胞特征对AM的影响"部分，IVW法鉴定出5种具有保护作用的免疫细胞类型，19个遗传预测的免疫细胞特征与AM风险增加相关，无显著异质性或多效性。"肠道微生物群及其代谢通路对免疫细胞的影响"部分，11个肠道微生物物种及相关通路对免疫功能具有保护作用，13个与免疫细胞特征风险增加相关。

"中介分析"部分，研究人员发现布氏瘤胃球菌对AM的效应由CD24⁺CD27⁺细胞上的CD24表达显著介导，该中介在保护性通路中占总效应的32.91%。"研究参与者的描述性特征"显示，45例女性中，AM组和对照组在年龄、产次、体重、身高、体质指数（body mass index, BMI）及妇科手术史方面无显著差异，但AM组的妊娠、痛经和月经不规律发生率显著更高。"宏基因组测序的多样性分析"显示，AM组与健康女性在属水平的α多样性及物种水平的β多样性均无显著差异。"宏基因组测序的物种差异分析"部分，LEfSe分析 cladogram 显示AM组以埃希菌属（包括大肠杆菌和艾伯塔埃希菌）富集为特征，对照组则以脱硫杆菌门、理研菌科、另普雷沃菌属和Marinifilaceae等富集为特征。LDA评分阈值>2的判别生物标志物分析显示，AM组中Enterocloster aldenensis、艾伯塔埃希菌、Clostridium Q symbiosum等丰度增加，对照组中理研菌科、另普雷沃菌属、Alistipes putredinis等贡献最大。ANCOM-BC差异丰度分析在调整年龄和BMI后，证实脱硫弧菌科和脱硫弧菌目在两组间仍保持统计学显著差异。

讨论部分，研究人员指出这是首次应用孟德尔随机化系统评估肠道微生物群、微生物代谢通路、免疫细胞表型与AM之间因果关系的研究。经双向MR排除反向因果后，10个分类群和10个通路被保留用于下游分析。在前向MR框架中，11对暴露-结局显示保护作用，13对显示风险增加；反向框架中，5个免疫特征显示保护作用，19个与风险增加相关。中介分析确立CD24⁺CD27⁺ B细胞上的CD24表达介导布氏瘤胃球菌对AM的保护性通路。尽管MR数据集为欧洲裔而宏基因组队列为中国人，但脱硫弧菌科/脱硫弧菌目在不同祖先间的一致性存在，提示AM的微生物贡献者可能超越种族差异。研究人员对关键微生物进行了机制阐释：模糊另普雷沃菌增强肠道屏障完整性、抑制Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）/NF-κB信号；扭链瘤胃球菌产生的2-羟基-4-甲基戊酸酯（2-hydroxy-4-methylpentanoate, HMP）抑制肠道HIF-2α-神经酰胺通路；布氏瘤胃球菌擅长淀粉降解、刺激丁酸产生、通过抑制组蛋白脱乙酰化酶（histone deacetylases, HDAC）调节炎症、激活G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptor, GPR）109A/GPR41/GPR43；副萨特菌属参与丁酸合成并通过GPR/HDAC3和脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）/TLR4/NF-κB信号通路纠正辅助性T细胞17（T helper 17, Th17）/调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）失衡。乳杆菌属的风险效应可能与其通过改变肠肝循环中的β-葡萄糖醛酸酶和β-葡萄糖苷酶破坏雌激素稳态有关。乳糖和半乳糖降解通路通过β-半乳糖苷酶将乳糖水解为半乳糖，后者吸收可能激活子宫内膜上皮细胞中的CCAAT/增强子结合蛋白β（C/EBPβ），上调S100A8发挥抗炎效应。丁酸促进Treg分化和免疫抑制，布氏瘤胃球菌可能通过抑制CD24⁺CD27⁺细胞上的CD24表达增强Treg活性和白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）分泌。研究局限性包括：粪便样本收集于临床诊断后但激素治疗或手术干预前，可能反映疾病状态本身或疼痛诱导的生理应激；健康对照为志愿者，存在志愿者偏倚；GWAS数据主要来自欧洲裔，推广性受限；宏基因组队列样本量较小；以及经多重检验校正后因果关联未达统计学显著性（p_FDR>0.05），但考虑微生物组广泛MR研究的探索性质和Benjamini-Hochberg程序的保守性，这些名义关联仍具提示价值。

结论部分，该研究通过孟德尔随机化和临床宏基因组分析提供了趋同证据，表明特定肠道微生物分类群、其相关代谢通路以及免疫细胞介导的机制可能参与AM的发病机制。13个肠道细菌分类群和11个微生物代谢通路与AM存在名义显著的因果关联，免疫细胞表型——特别是CD24⁺CD27⁺ B细胞上的CD24表达——可能作为肠道微生物群-AM轴上的中介发挥作用。这些发现为AM的发病机制提供了机制性见解，并确定了未来预防和治疗的候选微生物和免疫靶点。