准确且灵敏的TaqMan实时PCR检测方法，用于检测和定量猴疟原虫（Plasmodium cynomolgi、Plasmodium inui和Plasmodium coatneyi）

《Malaria Journal》：Accurate and sensitive TaqMan real-time PCR assays to detect and quantify simian malaria parasites Plasmodium cynomolgi, Plasmodium inui and Plasmodium coatneyi

摘要

背景

在东南亚的多个国家，已经报告了人类感染猴类寄生虫（如 Plasmodium inui、P. cynomolgi 和 P. coatneyi）的病例。尽管这些寄生虫引起的感染大多无症状且症状轻微，但这可能会阻碍该地区根除疟疾的努力。在本报告中，我们概述了基于 TaqMan 的新型实时 PCR 测定方法的发展和优化过程，这些方法能够准确识别和定量 P. inui、P. cynomolgi 和 P. coatneyi。

方法

针对 P. inui、P. cynomolgi 和 P. coatneyi 的 18S rRNA 基因中的不同区域，设计了物种特异性的水解探针用于实时 PCR 测定。这些测定方法在含有目标 18S rRNA 基因的质粒 DNA 以及其他人类和猴类 Plasmodium 物种 18S rRNA 基因片段的质粒 DNA 上进行了测试。此外，还使用通过嵌套 PCR 测定确认为猴类 Plasmodium 阳性的猕猴和 Anopheles 蚊子的基因组 DNA 样本进行了进一步测试。

结果

所开发的测定方法表现出高特异性，仅扩增其相应 Plasmodium 物种的目标 18S rRNA 基因。这些测定方法能够检测并定量每 PCR 反应中低至 10 个模板 DNA 复本（相当于大约 5 个寄生虫），扩增效率超过 95%。每种测定方法生成的标准曲线显示了拷贝数（10–10⁶ 个拷贝）与循环阈值（Ct）值之间的线性关系。这些测定方法的准确性还得到了其结果与常规嵌套 PCR 测定方法相当的结果的支持。

结论

新开发的测定方法可以准确检测和定量 P. inui、P. cynomolgi 和 P. coatneyi，检测限约为 5 个寄生虫。鉴于实时 PCR 的高效性，这些测定方法可以用于动物源性疟疾普遍存在的地区的常规疟疾监测。此外，这些测定方法也适用于检测亚显微感染以及寄生虫密度较低的蚊子样本。