探索溃疡性结肠炎的新型动物模型：评估化学诱导与患者来源微生物触发因素以提升转化相关性

《Laboratory Animal Research》：Exploring new animal models of ulcerative colitis: evaluating chemical and patient-derived microbial triggers to advance translational relevance

溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）是一种累及结肠的慢性炎性疾病，其病因涉及遗传、免疫、环境及微生物等多因素。肠道微生物组改变是UC的一致特征，但其对疾病发生和发展的因果贡献尚未明确。当前动物模型主要依赖化学或基因诱导，无法捕获人类疾病所特有的宿主-微生物组相互作用的复杂性。为弥补这一局限并提升临床前研究的转化相关性，本研究采用患者来源的微生物群模拟UC相关菌群失调，并单独及联合化学诱导方法探究其对疾病的影响。研究人员比较了三种不同UC诱导触发因素的小鼠模型：葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulphate Sodium, DSS）、来自UC患者的粪菌移植（Faecal Microbiota Transplantation, FMT）以及二者的联合（COMB）。DSS和COMB处理诱导了显著的临床症状，而单独FMT仅引起轻度改变，这可能归因于较短的暴露时间。免疫表型分析显示各模型存在独特的免疫特征，所有组的结肠黏膜均有白细胞和中性粒细胞浸润，表明微生物群本身即可引发局部免疫激活。转录组学分析显示，FMT显著调控紧密连接蛋白和黏蛋白基因表达，并诱导与人类UC相似的微生物组改变。相比之下，DSS触发了强烈的促炎转录反应并降低微生物多样性，但其组成性改变大多与UC患者相反。COMB模型结合了两种方法的特征——产生与DSS相似的临床症状和炎症激活，以及与FMT相似的紧密连接调控紊乱。

炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）是累及胃肠道的慢性、多因素疾病。虽然在西方国家IBD发病率已趋于平稳，但在东亚及高收入亚太地区仍持续上升。溃疡性结肠炎作为IBD的两种主要形式之一，以始于直肠并局限于结肠的连续性黏膜炎症为特征，与克罗恩病（Crohn's Disease, CD）的节段性、透壁性炎症形成对比。UC病因复杂，马铃薯涉及遗传易感性、环境因素、免疫失调及肠道微生物组改变，其中关键目标之一是识别诱发失调免疫反应的触发因素。

为研究UC发病机制及测试新型疗法，已开发多种动物模型，各模拟疾病的不同方面。化学诱导模型如葡聚糖硫酸钠（DSS）直接损伤上皮，导致屏障破坏、中性粒细胞浸润、溃疡形成及血便等症状。半抗原模型包括三硝基苯磺酸（TNBS）和噁唑酮，分别产生Th1极化和Th2偏斜的炎症反应。基因工程模型如Il10、Il2、Mdr1a或Muc2敲除鼠对阐明肠道免疫和炎症中的基因功能具有重要价值，但这些模型依赖完全基因缺失，不能反映人类疾病的遗传背景。现有UC模型大多缺乏可能是UC发病关键因素的复杂微生物刺激。

肠道微生物组紊乱与UC发病密切相关，表现为微生物多样性总体降低、稳定性下降及关键分类群改变。为研究宿主-微生物相互作用，已开发数种感染模型，但这些模型或导致全身感染，或需免疫操作，均无法重现人类疾病中复杂的微生物改变。因此，亟需能更忠实再现UC免疫学和微生物学特征的前临床模型，以提高治疗开发的转化相关性。

本研究旨在探究UC患者粪菌移植（FMT）作为结肠炎微生物触发因素的效果，并与广泛使用的DSS模型及其联合应用进行比较，以建立更能捕捉UC复杂性的转化相关模型。研究采用81只特定病原体自由（Specific Pathogen-Free, SPF）雌性BALB/c小鼠（6周龄），在无菌条件下饲养。为建立伪无菌小鼠模型，所有实验小鼠接受5天抗生素处理（阿莫西林/克拉维酸和环丙沙星，每12小时给药）及10天恢复期。FMT供体为20岁女性急性UC患者（Mayo评分=2），无抗生素、糖皮质激素或生物制剂治疗史。

实验分组包括：对照组（C0，实验开始时处死的抗生素处理后动物）、DSS组（5% DSS饮水，5天）、FMT组（UC来源FMT灌胃，每24小时一次，5天）和COMB组（DSS饮水联合FMT灌胃，均5天）。采用修订版疾病活动指数（Disease Activity Index, DAI）评估临床结肠炎严重程度，该指数综合直肠出血（0-6分）、粪便一致性（0-6分）和体重减轻（0-4分）。免疫表型分析涵盖结肠黏膜、派尔集合淋巴结和脾脏的单细胞悬流式细胞术分析，检测白细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤（Natural Killer, NK）细胞和NK T细胞（NKT）等群体。通过16S rRNA测序评估微生物组成，RNA测序（RNA-Seq）进行结肠黏膜转录组分析，聚焦紧密连接蛋白和黏蛋白相关基因及炎症相关细胞因子和趋化因子。

临床结果显示，所有组DAI均显著升高。FMT组仅出现轻度疾病，期末DAI约2.5；DSS组从诱导首日起DAI持续进行性升高，期末达约9，表现为最严重临床表型；COMB组呈中等程度，期末DAI约7， consistently低于DSS组但高于FMT组，表明三种方案模拟了不同严重程度的临床疾病。

免疫表型分析揭示各诱导方法产生不同的免疫应答。结肠黏膜中，所有实验组白细胞和中性粒细胞均较对照增加，FMT组中性粒细胞扩增最显著而DSS组最轻；所有实验组巨噬细胞百分比显著降低；NKT细胞变化趋势各异，FMT和COMB组降低而DSS组增加。NK细胞与中性粒细胞呈强负相关（rs(28)=-0.79, p=0.0009）。DSS组B淋巴细胞减少，FMT和COMB组NK细胞和细胞毒性T细胞（CD4-CD8+）显著降低。派尔集合淋巴结中，辅助性T细胞（CD4+CD8-）在所有实验组显著增加，COMB组增幅最大；DSS组细胞毒性T细胞减少而辅助性T细胞增加。脾脏中，DSS处理导致最显著的偏离，白细胞和B淋巴细胞百分比降低，总T细胞和辅助性T细胞增加；FMT单独或联合DSS主要导致B淋巴细胞增加。

转录组学分析显示，层次聚类分析（HCA）中DSS组与对照组最为相似，聚类在一起，而FMT和COMB组单独聚类。主成分分析（PCA）显示C0和FMT组内样本聚类最紧密，DSS组样本离散度最大且部分与C0重叠。差异表达基因（DEGs）分析支持这些发现，DSS和C0共享最少数量的DEGs（2,723个）；COMB和FMT最为相似，有4,284个DEGs；COMB和DSS差异最大，达8,226个DEGs。

在114个紧密连接、黏蛋白、细胞因子和趋化因子相关基因中，52个在至少一个实验组中差异表达。DSS单独处理对紧密连接蛋白表达影响最小，仅Ocln下调；而FMT单独或联合DSS（COMB组）导致紧密连接基因 panel 中超过一半基因下调。KEGG富集分析证实，紧密连接通路（mmu04530）在FMT和COMB组显著下调，而DSS组未显著改变。黏蛋白 panel 显示相反效应：大多基因在FMT组较对照下调，而Muc2和Muc4在DSS组上调；COMB组仅Muc16显著上调。黏液型O-聚糖生物合成通路（mmu00512）在FMT组显著下调，DSS组上调，COMB组无显著变化。趋化因子和细胞因子 panel 中，FMT组诱导后DEGs最少，仅Ccl28和Tgfb2差异表达；DSS处理后多个基因上调，Tgfb2下调；COMB组DEGs最多，除Ccl28外均上调。KEGG富集分析显示DSS组多个细胞因子和趋化因子相关通路显著上调，而COMB组仅细胞因子-细胞因子受体相互作用通路（mmu04060）显著上调，FMT组无相关通路上调。

微生物多样性分析显示，抗生素处理后观测物种数显著降低，且任何UC诱导方法均未能恢复。α多样性方面，ACE和Chao1指数在DSS和COMB组较INT和C0显著降低；FMT组仅较INT显著降低。Shannon、Simpson和PD whole tree指数在DSS和COMB组较INT显著降低，但相对于C0无显著变化；而FMT组Shannon和Simpson指数较C0显著增加，提示多样性增强。组间比较仅见Simpson指数在DSS和COMB组低于FMT，Shannon指数DSS低于FMT。β多样性分析中，UPGMA和PCoA均显示DSS和C0微生物群落组成最相似，聚类紧密；FMT组微生物组成最为独特，在PCoA中距其他组最远，UPGMA中最后加入主聚类。Adonis和MRPP结果支持这些发现。LEfSe分析识别各实验组独特微生物标志物：FMT组标志物最多（22个），涵盖门（Firmicutes和Proteobacteria）至种（Proteus mirabilis和Clostridioides difficile）多个水平；DSS组标志物主要来自Bacteroidota门；COMB组标志物最少（4个）。t检验进一步支持LEfSe结果：门水平上，FMT组Firmicutes丰度显著高于对照及DSS和COMB组，Bacteroidota丰度显著降低；科水平上，所有实验组较C0一致表现为Lachnospiraceae和Oscillospiraceae增加、Enterococcaceae减少，Peptostreptococcaceae在FMT组增加而DSS组减少，Clostridia vadinBB60组在DSS和COMB组增加。与FMT比较，DSS和COMB组均显示Muribaculaceae和Clostridia vadinBB60组丰度较高，Enterococcaceae、Peptostreptococcaceae和Erysipelotrichaceae较低。

讨论部分首先指出肠道微生物组改变是UC的标志，但现有实验模型很少纳入这些微生物变化。研究人员使用UC患者粪菌移植诱导小鼠结肠炎，并与广泛使用的DSS模型及联合触发比较，探索更具转化相关性的方法。结果显示单独FMT对总体DAI影响最小，5天诱导期可能不足以使FMT产生明显临床症状，文献提示无菌小鼠长期定植更有利于疾病发展。相比之下，DSS诱导DAI快速升高，更接近暴发性结肠炎而非大多数UC患者的轻至中度活动。有趣的是，COMB方案产生中等但持续的DAI升高，显著高于FMT和对照但持续低于DSS组，表明UC微生物群与化学触发联合产生临床可识别但非暴发性的结肠炎，可能更好地模拟人类UC的典型轻至中度疾病活动，同时允许研究菌群失调的贡献。

免疫细胞分析显示各诱导刺激产生不同免疫应答，但所有三组均表现明显炎症反应，以白细胞和中性粒细胞浸润结肠为特征，证明UC微生物群单独足以引发黏膜炎症。巨噬细胞在所有组中意外减少，研究人员推测这反映了组织常驻F4/80^hi CX3CR1^hi巨噬细胞的行为，这些细胞在稳态时发挥抗炎功能，炎症期间被单核细胞来源的巨噬细胞替代；未来研究需结合F4/80与CX3CR1等更多标志物精确解析这些亚群。

NK和NKT细胞群体变化尤为显著。FMT单独或联合DSS导致NK和NKT细胞减少，而单独DSS导致NKT细胞增加。NK细胞 depleted 小鼠中性粒细胞增加并快速死于DSS诱导的结肠炎，与本研究NK细胞与中性粒细胞负相关一致，提示NK细胞缺失可能允许过度中性粒细胞积累。NKT细胞采用表型定义（CD8⁺ CD49b⁺），基于Bayne等建立的策略；观察到趋势与已知微生物依赖的NKT生物学一致，抗生素处理动物NKT细胞增加。DSS主要触发急性、NKT主导的天然免疫应答，而FMT和COMB将平衡从天然细胞毒性效应细胞转向适应性淋巴细胞驱动炎症，更接近人类UC黏膜特征性的淋巴浆细胞浸润。

适应性免疫分析显示，B细胞在炎症条件下的浸润和扩增在派尔集合淋巴结、脾脏及UC炎症黏膜中均有文献记载。本研究中DSS处理与所有三个区室中B细胞相对频率降低相关，最明显于派尔集合淋巴结和脾脏，反映髓系偏倚、B细胞贫乏的炎症模式。相反，接受UC微生物群的小鼠在派尔集合淋巴结和脾脏显示B淋巴细胞比例增加，结肠中B细胞保留或轻度增加，这种B细胞富集型更接近人类UC黏膜慢性淋巴浆细胞浸润描述，提示UC微生物群是B细胞应答的主导驱动因素。COMB方案因此结合了DSS诱导的上皮损伤和临床炎症与微生物群驱动的B细胞富集免疫景观。

辅助性T细胞在派尔集合淋巴结所有组显著增加，脾脏仅DSS组增加，与既往实验结肠炎中Th细胞扩增报告一致。CD8⁺ T细胞水平存在重要差异：DSS组无显著变化，与Stevceva等报告一致；而COMB组结肠CD8⁺ T细胞增加，仅在COMB组观察到，提示UC微生物群和上皮损伤的联合作用是在结肠中触发UC样细胞毒性T细胞反应所必需的。

转录组学分析进一步揭示了DSS和FMT驱动炎症的不同途径。UC来源微生物群诱导更 robust 的结肠转录组改变，FMT和COMB组DEGs数量高于DSS组。微生物群对结肠黏膜的影响在紧密连接和黏蛋白相关基因表达中最为明显，而DSS对炎症相关基因转录影响更大。肠道上皮屏障（Intestinal Epithelial Barrier, IEB）缺陷长期被认为是IBD的标志，本研究提示微生物群可能是IEB调控紊乱的关键驱动因素，观察到UC FMT后紧密连接基因显著下调，与UC活检报告一致。有趣的是，"屏障削弱"性claudin Cldn2也下调；DSS仅显著改变一个紧密连接基因Ocln，提示DSS主要通过蛋白质重新分布等翻译后机制破坏IEB，而微生物群可能通过转录调控促进屏障功能障碍。类似地，微生物群对黏蛋白表达影响更大，且可能与DSS效应相反甚至拮抗。

DSS诱导更强炎症反应，多个关键趋化因子和细胞因子上调，其中许多在UC患者中升高并参与发病。单独UC微生物群对炎症相关基因表达影响 minimal，但FMT和DSS联合效应导致比单独DSS更多基因上调，提示潜在协同作用。最具显著性DEGs分析支持DSS管理诱导更严重炎症反应：Gsdmc2、Gsdmc3和Gsdmc4属于gasdermin家族，与肠道炎症和IBD易感性相关；Ggt1为亚临床炎症和氧化应激早期标志物；Mt1在DSS诱导结肠炎模型中显著过表达；Krt7与结直肠癌相关且在COMB组表达更高。COMB组上调基因包括IBD损伤中过表达且与疾病严重程度相关的Osmr；增强血管通透性促进中性粒细胞和单核细胞浸润的Mmp3；以及调节适应性免疫的干扰素诱导跨膜蛋白Ifitm1和Ifitm3。长链非编码RNA H19在COMB组表达增加，其对IEB的有害效应可能与发病机制相关。与DSS组相比，COMB组Slit2上调，而该基因表达降低已在UC中观察到。FMT组显著性DEGs同样涉及炎症和UC发病机制：Mptx下调与炎症和结肠炎易感性增加相关；Meg3下调被认为在UC中具有保护作用；Snhg11（小核仁RNA宿主基因）过表达与结直肠癌相关。

微生物组分析显示FMT和DSS作为诱导方法之间存在明显区别，COMB方案主要在UC样菌群失调群落上叠加了DSS诱导的多样性丧失。α多样性降低是IBDs的已确立标志，DSS处理复制了这一特征，且与FMT联合时该负面影响持续，表明DSS即使在移植微生物群存在下也对α多样性产生主导、持久的有害影响。此前研究报道FMT应在短期内 counteract 抗生素对物种丰富度和均匀度的有害影响，但本研究中UC来源FMT仅恢复Simpson指数至抗生素前水平，提示移植的微生物群本身即菌群失调，无法完全重建健康、多样的微生物群。

β多样性分析进一步强调差异：基于加权UniFrac距离的层次聚类和PCoA将FMT和COMB群落聚类在一起，与C0/INT和DSS明显分离，表明DSS与FMT联合不会将微生物群恢复为DSS样特征，而是在严重结肠炎背景下维持FMT来源的群落。LEfSe分析证实FMT组微生物标志物最符合IBD患者描述特征：Proteobacteria门增加是UC一致报告；其中Gammaproteobacteria纲、Morganellaceae科、Providencia属和Proteus mirabilis种均与肠道炎症相关。Firmicutes门在FMT组增加与多数文献矛盾，但其中Clostridia纲、Peptostreptococcaceae科和Anaerotruncus属已被牵连于UC；此外Clostridioides difficile作为FMT组标志物进一步支持转移的UC微生物群的炎症潜力。另一方面，DSS组微生物改变大多与IBD微生物组发表发现矛盾：Bacteroidaceae、Paludicola和Muribaculum、Bacteroides caecimuris作为DSS组标志物，而既往报告这些分类群在UC中减少或仅与治疗反应而非活动性疾病相关。Lachnospiraceae和Oscillospiraceae科在所有诱导方法中作为对照组的标志物出现，但Lachnospiraceae在UC中主要报告减少，Oscillospiraceae较高丰度与IBD治疗反应相关。DSS单独主要 capture 多样性丧失而非UC的特征性分类配置。COMB组未产生大量独特标志物，但保留了两种触发因素的关键元素：DSS样α多样性降低和FMT来源的UC样分类群。

从转化角度，单独FMT最能 recapitulate 人类UC菌群失调的组成特征，而COMB方案提供了一种背景，其中这种菌群失调的UC来源微生物群在DSS诱导的急性结肠炎背景下得以维持。这补充了主要反映非特异性多样性丧失而无UC样微生物特征的DSS模型，支持在同时靶向炎症和菌群失调微生物群的干预评估中使用COMB。

研究结论部分指出：本研究比较了化学、微生物及联合诱导策略以模拟溃疡性结肠炎的不同方面。单独DSS主要 reproduced 急性、中性粒细胞主导的结肠炎，伴有最明显临床症状、趋化因子和炎症相关基因上调及微生物α多样性显著丧失，但具有B细胞贫乏的免疫特征和仅部分类似UC菌群失调的微生物组配置。UC微生物群转移（FMT）建立了具有与UC患者一致微生物特征的菌群失调群落，诱导了 robust 的紧密连接和黏蛋白基因转录调控紊乱，以及肠道相关和全身淋巴器官的B细胞扩增，但仅引起轻度临床疾病。联合方案（COMB）整合了两种方法的关键特征：保留了DSS样临床炎症和多样性丧失，同时增加了UC样屏障基因抑制、B细胞富集免疫景观和UC相关性细胞毒性CD8⁺ T细胞反应，以及最广泛的UC相关炎症基因激活如OSMR、MMP3、H19和IFITM1/3。通过在DSS驱动的天然上皮损伤基础上 engaging 适应性淋巴细胞区室，COMB部分补偿了经典急性DSS结肠炎缺乏T和B细胞依赖性的不足，使其免疫细胞景观更接近人类UC观察到的特征。因此，COMB独特地捕获了单独DSS无法实现的菌群失调微生物群、上皮屏障功能障碍和黏膜炎症之间的相互作用。总之，数据表明FMT特别适合研究微生物群驱动机制，而COMB模型为在急性炎症、淋巴细胞丰富的结肠中测试同时靶向肠道屏障和菌群失调微生物群的干预提供了补充性、更具UC样特征的背景。这些微生物群包容性模型的进一步改进和验证对于增强其稳健性和转化适用性至关重要。