用于牛奶中高致病性禽流感H5N1逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测的实验室间评价的高适用性、高质量能力验证样品的研制

《Food and Environmental Virology》：Development of Fit-for-Purpose, High Quality Proficiency Samples for Interlaboratory Evaluation of RT-PCR Detection of HPAI H5N1 in Milk

对牛奶中高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza, HPAI）检测需求的增加凸显了获得表征良好的样品以实现对现有检测方法进行有意义评价的关键需求。在本研究中，研究人员聚焦于人工污染加标牛奶样品的研制与严格表征，为检测方法性能的可靠评估奠定基础。通过采用逆转录数字聚合酶链式反应（reverse transcriptase digital PCR, RT-dPCR），研究人员获得了病毒储液及加标样品中精确的基因组拷贝数（genome copy, GC）测量结果，即使在低病毒载量下也能实现准确定量。与此同时，美国农业部国家兽医服务实验室（U.S. Department of Agriculture National Veterinary Services Laboratories, USDA-NVSL）的甲型流感基质基因（influenza A matrix gene, IAV M）实时逆转录聚合酶链式反应（real-time reverse transcriptase PCR, rRT-PCR）检测被用作主要检测方法，作为验证样品制备方法的工具。本工作的目标是证明可以产生稳健、可重复且分析可追溯的样品，以支持全国范围内分发的能力验证练习（proficiency exercises, PEs）中的HPAI方法评价。样品间的低标准偏差，复现样品rRT-PCR循环阈值（threshold cycle, Ct）值范围为0至0.10，低于指示异质性的理论阈值，同时RT-dPCR对样品GC的测定证实了所研制样品的均一性。对相应牛奶基和磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）基样品的平行分析未显示基质效应迹象。随时间推移未观察到Ct值或测量GC值的显著变化，证明样品在-80°C储存时至少28天内稳定。USDA-NVSL的IAV M rRT-PCR检测的测定灵敏度，以检测限50%（level of detection 50%, LOD_50%）表示，牛奶样品为每rRT-PCR反应3.2 GCs，PBS样品为每rRT-PCR反应5.5 GCs，但这一差异无统计学意义。本工作为确定实验室能力奠定了基础，为正在进行和未来的监测中的HPAI熏陶结果提供了信心。

2024年3月，美国德克萨斯州报告了首例奶牛感染高致病性禽流感A H5N1（HPAI）的确诊病例，此后生牛奶中检测到高浓度传染性H5N1病毒，引发了公众对牛奶供应安全的重大关切。早期检测对于及时实施遏制措施至关重要。为应对这一公共卫生挑战，美国农业部动植物卫生检验（Animal and Plant Health Inspection Service, APHIS）发布联邦命令，要求对跨州移动的奶牛进行甲型流感检测和报告，并随后实施国家牛奶检测战略（National Milk Testing Strategy, NMTS）对生牛奶进行检测。这些措施推动了兽医和公共卫生实验室网络中HPAI检测的快速扩展。然而，当前检测多依赖于USDA-NVSL开发的rRT-PCR检测方法，相关标准操作程序内部文件对牛奶样品的具体处理缺乏详细指导，且检测结果的可靠性依赖于方法的正确验证和实验室的规范实施。实验室间能力验证（包括能力验证试验和实验室间比对试验）是确认方法可靠性、识别性能差距的重要手段。为保证检测在全国范围内的可靠性和可比性，亟需制备专门针对牛奶中HPAI检测的结构化能力验证样品。

该研究由美国食品药品监督管理局兽医信息实验室响应网络（Veterinary Information Laboratory Response Network, Vet-LIRN）与莫菲特能力验证实验室（Moffett Proficiency Testing Laboratory, MPTL）合作开展，旨在评价基于NVSL标准操作程序的rRT-PCR方法用于牛奶中HPAI检测的性能，最终支持未来实验室间练习的开发。研究样品来自市售巴氏消毒全脂牛奶，经筛查确认无IAV M基因干扰后使用。

研究采用的关键技术方法包括：以β-丙内酯（binary ethylenimine, BEI）灭活的H5N1病毒作为加标材料；采用USDA-NVSL的IAV M基因rRT-PCR检测作为主要表征方法，在Applied Biosystems 7500 Fast实时荧光定量PCR仪上运行；采用Thermo Fisher Absolute Q平台进行RT-dPCR绝对定量分析，利用泊松统计学原理计算GC浓度；运用QuoData认证的专业统计工具箱进行数据处理，其中采用互补对数-对数（complementary log-log, cloglog）回归模型计算概率检测（probability of detection, POD）和LOD_50%，采用随机效应模型依据ISO 13528:2022标准评估样品均一性，采用MU-Hampel程序进行稳定性评估；样品在0、7、14、21、28天五个时间点进行测试，储存于-80°C。

病毒在牛奶样品中的稳定性

研究人员通过在不同时间点检测加标牛奶样品，评估了病毒的稳定性。结果显示，在-80°C储存条件下，样品在28天内保持稳定，Ct值未观察到显著变化。各时间点的扩增效率普遍较高，范围为85%至97%，仅第21天为74%，但各时间点间无显著差异。在10²、10³、10⁴ GCs/rRT-PCR反应孔水平，Ct值变异较小；而在10¹和5 GCs等低浓度水平，Ct值变异增大，且出现偶发的未检出情况。MU-Hampel稳健均值分析显示，各GC水平的平均Ct值及其差值符合预期，表明所制备样品具有良好的时间稳定性。

样品均一性

研究人员依据ISO 13528:2022标准，采用随机效应模型评估样品均一性。基于Ct值的分析显示，样品间标准偏差（即不同样品重复之间的标准偏差）范围为0至0.10 Ct值，已校正日期效应和样品内标准偏差（即所有不同样品重复的重复孔平均标准偏差）。换算为每rRT-PCR反应孔的GCs，相对样品间标准偏差为0.0%至6.4%。由于样品间标准偏差只能间接估计且伴随相当大的统计不确定性，研究人员还计算了95%概率下非零的未知理论标准偏差阈值。对于所有五个浓度水平，必须假设存在异质性的阈值均明显高于相应计算得到的标准偏差，因此rRT-PCR结果证明样品具有高度的均一性。RT-dPCR补充测定进一步证实了样品的GC数值。

rRT-PCR检测的LOD_50%

研究人员采用概率检测方法评估了检测灵敏度。结果显示，牛奶样品的LOD_50%为每rRT-PCR反应孔3.2 GCs，PBS样品为每rRT-PCR反应孔5.5 GCs。在1 GC水平几乎无检出，2至5 GCs水平检出结果不稳定。实测检出率由低GC样品在重复PCR孔中的检测结果计算，POD以模型曲线表示。虽然牛奶的LOD_50%数值略低于PBS，但这一差异无统计学意义，表明本研究中牛奶未产生基质效应。阳性提取对照和内部阳性对照均未显示抑制效应，进一步支持这一结论。

RT-dPCR确认牛奶样品基因组拷贝数

研究人员采用RT-dPCR对提取的牛奶样品进行GC测定，结果与计算预期值高度一致。相同样品重复水平在各时间点显示出一致的GCs，未观察到日期特异性趋势或不稳定现象。预期为1.25×10³ GCs/μL的样品与计算值一致，准确且精确；1.25×10¹和1.25×10² GCs/μL的样品测量值略低于计算值，但仍保持良好的一致性。低浓度样品（1.25和0.625 GCs/μL）的变异性较高，符合预期。RT-dPCR结果确证了样品制备和定量方法的准确性。

讨论部分，研究人员首先强调了样品均一性和稳定性对于能力验证的核心重要性。根据ISO 22117:2019和ISO 17043:2023，能力验证样品提供者必须确认样品具有等效的特征化特性。本研究通过rRT-PCR和RT-dPCR两种方法的相互印证，证明了样品的高度均一性和28天稳定性，为能力验证组织者提供了充足的测试和分发时间窗口。研究人员指出，pasteurized store-bought milk作为模拟基质是能力验证样品的合适标准基质，因其零售制备过程限制了可能的基质相关效应，但需承认其与真实散装奶罐样品可能存在差异。

关于检测灵敏度，研究人员分析了低GC样品的重要意义。传统能力验证方案通常会忽略低GC样品产生的部分阳性结果，但本研究有意纳入这些样品以评估方法的灵敏度和可靠性。早期研究中报告的LOD为10⁴ copies/mL（即10¹ GCs/μL），相当于100头奶牛中有1头感染并排放10⁶ H5N1 copies/mL的情况。本研究确定的更低检测限有助于在感染初期实现病毒检出，对于及时实施遏制措施、防止HPAI在奶牛群体内及群体间进一步传播、减少潜在跨种传播具有重要意义。研究人员特别指出，虽然牛奶的LOD_50%略低于PBS，但3 GCs数据点仅来自4个重复样品（8个PCR孔），若增加重复数，牛奶的LOD_50%可能与PBS更为接近；两种基质LOD_50%的差异无统计学意义。

此外，研究人员讨论了Poisson分布效应对低浓度样品检测变异性的影响。当样品中GC数接近LOD_50%时，遗传物质在提取液中的随机分布导致检测结果出现正负混合，这正是计算LOD_50%的基础。这种变异性既源于RT-PCR检测本身的测量变异，也与取样不一致性有关。使用经过牛奶基质验证的提取试剂盒（如MagMAX CORE）对于高效分离遗传物质至关重要，而提取前对牛奶样品进行稀释处理是减少基质抑制的可靠方法。

研究结论指出，本研究成功制备了高质量的能力验证样品，实现了对NVSL的IAV M rRT-PCR方法用于牛奶中HPAI A（H5N1）检测的适用性评价。通过在系列GC水平下将灭活H5N1加标至牛奶中，研究人员确认了以下四个关键方面：病毒在-80°C储存的牛奶样品中的稳定性；样品在28天内跨加标水平的均一性和稳定性；rRT-PCR与RT-dPCR评估样品GC值的一致性；以及使用POD作为GC水平函数确定牛奶与PBS中LOD_50%的方法灵敏度。这些要素均在能力验证开发中发挥关键作用。总体而言，研究结果证实所实施的方法适用于能力验证样品的核查，用于产生加标牛奶样品的样品制备方法能够生产出充分均一且稳定的能力验证材料，可用于未来的实验室间练习。所呈现的数据为未来HPAI牛奶能力验证项目提供了实用框架，并支持将该NVSL方法作为核查能力验证样品质量的内部表征检测方法使用。