利用液相色谱技术探索 Mugil cephalus 肠道微生物组中的抗菌剂

《Future Journal of Pharmaceutical Sciences》：Exploring the gut microbiome of Mugil cephalus for antibacterial agents using liquid chromatography

由于抗微生物药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）带来的全球性挑战，迫切需要开发新药物以应对感染。研究人员推测，从未经开发的来源中分离的细菌，即来自生活在不洁环境中的物种的肠道微生物组，可能产生抗菌物质。本研究中，研究人员从埃及鱼类 Mugil cephalus 的肠道中分离细菌，并通过16S rDNA扩增和测序进行鉴定。分离的细菌菌落在最小培养基中培养，制备含有代谢物的条件培养基（conditioned media, CM），并通过抗菌试验检测其对选定的革兰氏阳性（Gram-positive）和革兰氏阴性（Gram-negative）多重耐药菌的抑制作用。条件培养基还通过乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）试验检测对人结直肠癌细胞（human colorectal cancer, HCT-116）的细胞毒性。抗菌分析结果显示，来自细菌菌株 Bacillus aerophilus 和 Staphylococcus xylosus 的条件培养基表现出广谱抗菌效应。特别是，来自 Bacillus aerophilus 的条件培养基显著抑制了细菌活力。含有细菌菌株代谢物的条件培养基对人细胞产生的细胞毒性极小。质谱分析揭示了多种抗菌、抗真菌、黄酮类、神经递质、鞘脂类、类固醇和抗癌化合物。这些结果表明，来自独特环境的细菌是分离具有抗菌特性分子的潜在来源，尽管需要体内研究来验证这些发现。

**研究背景与问题提出**

抗生素是二十世纪医疗保健领域的重大进步，已 extensively 用于治疗人类和动物感染以及作为动物饲料添加剂。值得注意的是，全球抗生素消费量在新世纪第一个十年激增35%，仅中国于2013年就使用了162,000吨抗生素，其中52%用于动物。这种广泛的使用促进了抗生素耐药微生物的出现，对全球公共卫生构成严重威胁。多重耐药感染导致高发病率和死亡率，尤其在低收入和中等收入国家更为严重。据预测，到2050年，抗生素耐药性疾病每年可能导致1000万人死亡，并造成100万亿美元的经济负担。除发现新型抗微生物药物外，迫切需要采取行动改进感染管理和提高公众意识，并通过协调的全球努力来规范抗微生物药物的使用。

鉴于肠道微生物组对其宿主健康和福祉的重要影响，研究人员近期开始探讨爬行动物、鱼类、鸟类和两栖动物等动物肠道微生物组来源分子的抗菌和生物活性特征。这些物种在自然环境中可能接触大量微生物，却能在这些条件下茁壮成长。研究人员推测，这些物种的肠道细菌可能产生并分泌众多防御性分子/化合物，使这些物种能够在竞争性环境中生存和繁殖。近期的免培养研究为鱼类肠道微生物组的分类学和功能多样性提供了一些见解，揭示了其与饮食、环境和宿主生理学的密切关联。尽管这些方法扩展了研究人员对微生物群落结构的理解，但将鱼类肠道细菌与功能性抗菌活性联系起来的研究仍然有限。本研究通过采用定向的、基于培养的策略，补充了现有的微生物组研究，以鉴定来源于肠道的具有抗菌潜力的细菌和代谢物。

**研究目的**

本研究利用埃及鱼类 Mugil cephalus，确定其肠道细菌是否具有抗菌活性，以作为当代抗生素的潜在来源。研究人员分离了肠道细菌，制备其含有代谢物的条件培养基，并针对选定的多重耐药菌以及人细胞进行毒性评估，以检测其抗菌活性和安全性。同时，研究人员进行了液相质谱分析以阐明肠道细菌来源分子的身份，并建议这些分子可作为新型生物活性分子库。

**主要技术方法**

本研究采用的关键技术方法包括：基于16S rRNA基因扩增和测序的细菌分离鉴定技术；条件培养基制备技术，即在无血清RPMI最小培养基中培养纯细菌培养物，通过离心收集含分泌代谢物的上清液；体外抗菌试验，包括条件培养基与靶标细菌的共培养、菌落计数法测定细菌活力，以及微量肉汤稀释法测定半数抑制浓度（IC₅₀）；细胞毒性评估，采用乳酸脱氢酶释放试验检测对人结直肠癌细胞（HCT-116，购自美国典型培养物保藏中心，ATCC）的细胞毒性；以及高效液相色谱-质谱联用（HPLC/MS）技术，使用TimsTOF质谱仪配合Apollo II电喷雾电离（ESI）源进行代谢组学数据分析，通过与人类代谢组数据库（Human Metabolome Database, HMDB）比对进行代谢物鉴定。样本来源为购自阿联酋沙迦市场的埃及鲻鱼（Mugil cephalus），研究获得研究伦理委员会批准（批准号：FRG20-L-S26）。

**研究结果**

**从 Mugil cephalus 肠道中分离并鉴定细菌**

为获得纯培养物，研究人员从 Mugil cephalus 肠道中分离的众多细菌在营养琼脂上进行了培养和传代。通过16S rRNA基因扩增和测序对分离的细菌进行鉴定，从中选择了抗菌活性最高的细菌提取物进行深入研究。鉴定结果显示，从 Mugil cephalus 肠道中分离并鉴定出 Shigella flexneri（登录号PV778081）、Bacillus aerophilus（登录号PV778082）、Staphylococcus xylosus（登录号PV778083）和 Salmonella enterica（登录号PV778084）。这些物种包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，其中一些以致病性（S. flexneri, S. enterica）或环境适应性（B. aerophilus）著称。研究人员为这四种细菌制备了含有分泌代谢物的条件培养基，并储存于-80°C以备后续使用。

**Mugil cephalus 肠道细菌代谢物（条件培养基）表现出显著抗菌活性**

研究人员通过体外抗菌试验检测了由 Mugil cephalus 肠道细菌制备的条件培养基对临床菌株的抗菌效果。抗菌试验结果显示，除CM1（来自 Shigella flexneri 菌株的代谢物）外，所有条件培养基（含有来自 Bacillus aerophilus、Staphylococcus xylosus、Salmonella enterica 细菌的代谢物）均对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）表现出显著杀菌效果。CM2表现出最高的抗菌活性，可杀灭83%的细菌；CM3和CM4分别消除了68%和25%的MRSA。当测试对 S. pyogenes 的作用时，CM2表现出卓越的杀菌活性，消灭了96%的细菌，而CM3将 S. pyogenes 减少了53%。所有条件培养基除CM4外，均对 B. cereus 表现出显著抗菌特性；CM1、CM2和CM3分别消灭了37%、75%和48%的细菌活力。

在针对革兰氏阴性菌的测试中，CM2和CM3对 S. marcescens 表现出58%和35%的杀菌效果。同样，CM2和CM3分别消除了38%和23%的 K. pneumoniae。针对 E. coli K1，仅CM2显示出46%的抗菌效果。最后，CM2和CM3对 P. aeruginosa 分别表现出73%和48%的杀菌特性。

半数最小抑制浓度（MIC₅₀）分析显示，选定的条件培养基在较低剂量下即呈现50%抑制效果。CM2和CM3分别在55.68 μL和79.13 μL剂量下对MRSA产生50%抑制效果。同样，针对 P. aeruginosa，CM2在64.62 μL时呈现IC₅₀，CM3在104.34 μL时呈现IC₅₀。

**来自 Mugil cephalus 肠道细菌代谢物的条件培养基对人细胞呈现有限细胞毒性**

乳酸脱氢酶细胞毒性试验结果显示，所有含有代谢物的条件培养基（由从 Mugil cephalus 肠道分离的细菌菌株 Bacillus aerophilus、Staphylococcus xylosus、Salmonella enterica、Shigella flexneri 制备）对人结直肠癌细胞（HCT-116）均表现出极小的细胞毒性。具体而言，CM1和CM2均显示20%的细胞毒性效应，而CM3和CM4分别显示28%和30%的对人细胞毒性。来自 E. coli K-12 的条件培养基呈现9%的细胞毒性活性。剂量依赖性结果显示，具有显著抗菌效果的条件培养基在更高剂量下才呈现CC₅₀，这进一步证明了这些条件培养基在对抗多重耐药性方面的治疗潜力。细胞毒性效应在高于抗菌活性所需浓度的浓度下才观察到。

**质谱分析揭示了丰富的次级代谢物谱**

质谱分析在从 Mugil cephalus 肠道制备的细菌菌株条件培养基中共鉴定出264种次级代谢物，使用人类代谢组数据库（HMDB）进行注释。检测到的化合物包括阿奇霉素、苯佐卡因、柚皮素、苯甲酸、癸酸、1,3,7-三甲基尿酸、3,5-二甲氧基苯酚、3-甲酚酸、3-甲基吲哚、5-苯基戊酸、喹啉酸和琥珀酸等。这些化合物中多种与抗菌特性相关：阿奇霉素是大环内酯类抗生素，常用于治疗下呼吸道感染；癸酸及其衍生物对主要食源性病原体空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）具有抗菌活性；苯甲酸是广谱抗微生物剂，对细菌和真菌病原体均有效；香芹酮则被证明可破坏膜完整性并对包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在内的细菌产生抗菌作用。

**讨论与研究结论**

过去，抗生素主要来源于土壤细菌。然而，由于这些药物的过度使用和开发减少，迫切需要探索新分子。研究人员推测，鱼类、爬行动物和无脊椎动物等动物的肠道微生物组可能产生对不同菌株具有抗菌作用的生物分子，尽管其确切性质和作用机制尚不清楚，这将是未来研究的主题。鱼类以在富含硫化氢等多样环境中茁壮成长而闻名，被认为是高度成功的外温动物。

本研究与以往研究一致，先前已有研究证明了爬行动物和啮齿动物来源的肠道细菌的抗微生物潜力：如从 Cuora amboinensis（龟）分离的 P. aeruginosa 产生了具有显著抗多重耐药菌能力的群体感应分子和生物表面活性剂；从大鼠肠道分离的 Bacillus subtilis 产生的多种抗微生物脂肽表现出强大的抗菌效果；从鳄鱼肠道分离的细菌产生了大量生物活性代谢物，显著消除了革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。与这些研究相比，本研究扩展了知识范围，通过鉴定来自 Mugil cephalus 肠道微生物组的独特细菌物种及其独特的代谢物谱，拓宽了探索生物活性化合物的宿主物种和细菌多样性范围。

尽管鱼类具有巨大的生态多样性，但对其肠道微生物群的理解仍处于初级阶段。Mugil cephalus 是埃及鲻鱼，本研究选择它是因为已知其接触多种重金属/污染物，并具有独特的香气。先前的研究揭示了鲻鱼肠道细菌对 varying 浓度盐的最佳耐受性，并分离了其肠道中的乳酸菌，但未能评估肠道细菌产生的代谢物或所产生分子的身份。本研究评估了从 Mugil cephalus 肠道分离的四种肠道细菌制备的条件培养基含有代谢物的抗菌效果，并使用分析工具确定了分子的身份。从 Mugil cephalus 肠道分离的四种细菌为：Shigella flexneri、Bacillus aerophilus、Staphylococcus xylosus 和 Salmonella enterica。

质谱分析鉴定了264种分子，其中特别值得关注的分子包括：阿奇霉素（大环内酯类抗生素的亚类，来源于红霉素）、香芹酮（广谱抗微生物化合物，在鱼肠道细菌中以更高丰度产生）、苯甲酸和琥珀酸（苯甲酸单独即对人类致病细菌和真菌具有广泛的抗微生物作用）、以及吲哚-3-甲醇（对多种多重耐药细菌和白色念珠菌表现出非凡的抗菌和抗真菌潜力）。这些分子采用不同的作用模式：阿奇霉素通过抑制蛋白质合成、阻止中性粒细胞入侵、减少促炎细胞因子产生和改变巨噬细胞极化来抑制细菌增殖；琥珀酸抑制 ATP 的产生；香芹酮则通过破坏质膜发挥抗菌作用。研究人员认为这些化合物可能通过破坏细菌膜或抑制其增殖来呈现类似作用机制，但精确的机制研究需要在未来的工作中进行。

本研究也存在一定局限性：细菌分离物主要基于其丰度进行选择，未来工作将侧重于分离更广泛、分类学更多样化的细菌集合，包括厌氧物种，以充分捕获鱼类肠道微生物组的代谢潜力。此外，研究人员 acknowledge 评估正常人细胞毒性的重要性，本研究之所以在HCT-116结肠癌细胞上进行细胞毒性测试，是由于其特征明确且可重复的反应谱，便于生物活性化合物的初步筛选。未来研究将扩展细胞毒性评估至正常人细胞系，如成纤维细胞、内皮细胞和外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs），以提供更全面的安全性评估。本研究采用了定向的、基于培养的方法，因此聚焦于可培养细菌分离物，而非捕获鱼类肠道微生物组的完整多样性。代谢物鉴定基于定性和半比较性质谱分析，没有进行绝对定量、化合物纯化或活性引导分离，因此单个代谢物的确切贡献和生物学相关性尚待确定。细胞毒性评估作为初步筛查使用癌细胞系进行，更广泛的正常人细胞评估将进一步评估宿主安全性。此外，机制表征（包括区分抑菌和杀菌效果）、生物合成验证以及与现有抗生素的比较基准测试也应进行。这些方面代表了未来更全面研究的重要方向。

**研究结论**：本研究从 Mugil cephalus 肠道中鉴定出四种细菌菌株：Shigella flexneri、Bacillus aerophilus、Staphylococcus xylosus 和 Salmonella enterica。从这些分离物衍生的代谢物对测试的多重耐药革兰氏阳性和革兰氏阴性病原体表现出显著的抗菌活性。鉴定的几种化合物还具有其他生物活性，包括抗真菌、抗癌和酶抑制特性。这些发现突出了鱼类肠道微生物组作为广谱抗微生物药物来源的未开发潜力。需要进一步的机制研究和体内研究来探索其治疗相关性。本论文发表于《Future Journal of Pharmaceutical Sciences》。