《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：A chronic whole cigarette smoke extract model reveals redox–mitochondrial adaptation in human lung epithelial and organoid models
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香烟烟雾（CS）施加持续的氧化和亲电应激，破坏肺部的细胞稳态。虽然急性吸烟暴露会诱导短暂的抗氧化反应，但上皮系统如何适应慢性烟雾仍不清楚。研究人员开发了一种慢性全CS提取物（WCSE）模型，该模型整合了气相和颗粒相成分，以再现长期吸烟暴露的复杂性。利用支气管上
香烟烟雾（CS）施加持续的氧化和亲电应激，破坏肺部的细胞稳态。虽然急性吸烟暴露会诱导短暂的抗氧化反应，但上皮系统如何适应慢性烟雾仍不清楚。研究人员开发了一种慢性全CS提取物（WCSE）模型，该模型整合了气相和颗粒相成分，以再现长期吸烟暴露的复杂性。利用支气管上皮细胞和人肺类器官，研究人员证明慢性WCSE暴露诱导了协调的氧化还原-线粒体适应，支持在持续性氧化应激下的存活。慢性暴露细胞（T-B2B）表现出凋亡减少、S期进入增强以及线粒体片段化但功能保留，其特征是稳定的膜电位和受限制的活性氧（ROS）积累。全外显子组测序（WES）在二维和类器官模型中揭示了氧化突变特征，将慢性氧化适应与烟草相关的基因组印记联系起来。机制上，NRF2（核因子E2相关因子2）活性通过翻译后稳定化和核积累得以维持，该过程独立于KEAP1（Kelch样ECH相关蛋白1），并伴随pAKT（磷酸化蛋白激酶B）激活和pGSK3β（磷酸化糖原合酶激酶3β）活性抑制。人肺类器官重现了这些适应，表现出增大的形态、凋亡减少和核NRF2积累，这与一种应激耐受、克隆持续的表型一致。总之，这些发现建立了一个慢性WCSE平台，该平台模拟了上皮对CS的早期适应，并揭示了NRF2依赖的氧化还原重塑作为吸烟相关肺损伤中长期存活的关键机制。
香烟烟雾（CS）是公认的致癌物，其成分包括数千种化学物质，通过诱导氧化应激、DNA损伤和慢性炎症促进呼吸系统疾病及恶性肿瘤发生。既往研究多采用短期暴露或单一相（气相或颗粒相）香烟提取物模型，无法全面模拟长期吸烟的复杂氧化环境。此外，传统二维培养和动物模型难以再现人气道上皮的结构与细胞复杂性，限制了慢性烟雾适应机制的研究。为突破这些局限，研究人员开发了一种整合气相和颗粒相的全CS提取物（WCSE）模型，并结合人支气管上皮细胞（BEAS-2B）和正常人肺类器官（hLO）建立慢性暴露平台，旨在揭示上皮细胞在持续性氧化应激下的适应机制及其与吸烟相关肺损伤的关联。该研究发表于《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》。
主要关键技术方法包括：利用SG-300吸烟机在加拿大卫生部剧烈抽吸模式下收集主流烟雾，经剑桥滤片分离总颗粒物（TPM）并捕获气相组分，混合制备WCSE；对BEAS-2B细胞进行40周连续100 μg/ml WCSE处理建立慢性暴露细胞系（T-B2B）；从三例独立供体正常肺组织分离细胞，包埋于基底膜提取物中培养并建立慢性暴露类器官（T-hLO）；通过CCK-8、Annexin V/7-AAD流式细胞术、Hoechst 33342/Ki-67染色分析活力、凋亡和细胞周期；运用MitoTracker Red、TMRM、MitoSOX和DCFDA评估线粒体形态、膜电位及ROS水平；对二维细胞和类器官分别进行全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS），分析突变谱及单碱基替换（SBS）特征；利用TCGA（癌症基因组图谱）数据库分析肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）中NRF2通路基因表达；通过免疫印迹、免疫荧光和核质分离检测蛋白定位与修饰；采用siRNA敲低NRF2验证其功能。
**Long-term WCSE exposure increases cell survival and promotes S-phase progression in bronchial epithelial cells**
通过CCK-8活力测定和形态学观察，T-B2B细胞在WCSE急性处理下存活率显著高于亲代B2B细胞，且凋亡率降低。细胞周期分析显示T-B2B中S期比例升高、G0/G1期减少，表明慢性暴露促进增殖和抗凋亡适应。
**Long-term WCSE exposure induces mitochondrial fragmentation and functional remodeling**
MitoTracker染色显示T-B2B线粒体呈现碎片化形态（面积和长度减小、圆度增加），但通过TMRM和MitoSOX/DCFDA检测发现其膜电位维持稳定，线粒体和总ROS水平低于B2B，表明线粒体功能保留且氧化控制增强。
**Long-term WCSE exposure induces a distinct mutational landscape characterized by oxidative stress**
WES分析显示T-B2B比B2B积累了更多突变，其中C>A颠换（氧化DNA损伤标志）显著增加。突变特征分析鉴定出SBS3、SBS5和SBS18，这些特征与吸烟相关肺癌中氧化损伤和DNA修复缺陷一致。
**TCGA analysis reveals NRF2 activation and antioxidant gene upregulation in lung squamous carcinoma and long-term WCSE-exposed cells**
TCGA数据表明LUSC中NRF2表达显著上调，且其靶基因（NQO1、GCLC、HO-1等）协同升高。在T-B2B细胞中，NQO1和PGC1α mRNA水平升高，而NRF2和KEAP1转录水平不变，提示NRF2通路在翻译后水平被激活。
**Chronic cigarette exposure stabilizes the NRF2 protein and promotes its nuclear accumulation**
免疫印迹和免疫荧光显示T-B2B中NRF2蛋白总量增加并在细胞核中富集，同时下游NQO1蛋白上调。核质分离进一步证实NRF2核积累，而mRNA水平未变，表明翻译后稳定化是主要机制。
**Chronic cigarette exposure promotes clonal expansion and mitochondrial adaptation in lung organoids**
慢性暴露类器官（T-hLO）体积增大、凋亡减少，且维持较高线粒体膜电位、较低ROS水平。免疫荧光显示NRF2在T-hLO中核积累，WGS检测到烟草相关突变特征SBS4，证实三维组织中同样发生氧化适应和基因组印记。
**NRF2-dependent survival in T-B2B cells is mediated by uncoupling stress from the AKT–GSK3β axis**
siRNA敲低NRF2使T-B2B对WCSE诱导的凋亡高度敏感。蛋白分析显示T-B2B中pAKT（磷酸化AKT）水平升高、pGSK3β（抑制性磷酸化GSK3β）水平降低，NRF2和NQO1蛋白上调而KEAP1不变，表明AKT-GSK3β轴通过KEAP1非依赖方式稳定NRF2，驱动持续性抗氧化防御。
**讨论与结论**
讨论部分强调，慢性CS暴露通过AKT–GSK3β–NRF2轴建立适应性反馈环路：持续性氧化应激诱导线粒体碎片化和基因组适应，同时激活抗氧化防御，维持细胞存活和克隆性扩张。人肺类器官模型重现了这些改变，为早期上皮适应提供了三维生理背景。该研究建立的慢性WCSE平台弥合了急性体外实验与长期病理重塑之间的差距，揭示了NRF2依赖的氧化还原-线粒体适应作为吸烟相关肺损伤中关键早期机制。
研究结论翻译：总之，研究数据支持一个模型：慢性香烟暴露建立了一个适应性反馈环路。持续性氧化应激诱导线粒体碎片化和基因组适应，同时激活AKT–GSK3β–NRF2轴以稳定抗氧化防御。这一互连网络帮助上皮细胞在氧化和DNA损伤挑战下存活，支持克隆存续，并为恶性前适应奠定基础。慢性WCSE模型结合人肺类器官捕捉了这一转变的关键特征，架起了急性体外分析与长期病理重塑之间的桥梁。这些发现为烟草研究提供了稳健的方法学平台，并揭示了长期烟雾暴露如何促进上皮适应，将NRF2依赖的韧性确定为吸烟相关肺癌发展中的关键早期标志。
