《Frontiers in Oncology》：An exploratory integrative analysis of plasma transcriptomic and proteomic predictors of response to total neoadjuvant therapy in locally advanced rectal cancer
编辑推荐：
摘要：局部晚期直肠癌（locally advanced rectal cancer, LARC）患者对全量新辅助治疗（total neoadjuvant therapy, TNT）的反应存在异质性。本研究旨在筛选并鉴定与LARC患者TNT治疗反应相关的血浆生物
摘要：局部晚期直肠癌（locally advanced rectal cancer, LARC）患者对全量新辅助治疗（total neoadjuvant therapy, TNT）的反应存在异质性。本研究旨在筛选并鉴定与LARC患者TNT治疗反应相关的血浆生物标志物，以预测病理完全缓解（pathological complete response, pCR）。研究方法为：对6例LARC患者（3例pCR和3例non-pCR）进行TNT治疗前血浆核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）测序和功能注释，以识别与TNT反应相关的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。随后，采用Olink? Target 96 Oncology II panel在61例LARC患者（20例pCR vs. 41例non-pCR）、6例直肠腺瘤（rectal adenoma, RA）患者及6例健康参与者中对部分DEGs进行蛋白质水平的验证。分析TNT治疗前血浆差异表达蛋白（differentially expressed proteins, DEPs）与LARC患者临床病理特征及TNT反应之间的相关性。研究结果显示：与non-pCR组相比，pCR组有365个DEGs上调，198个DEGs下调。这些基因涉及细胞生长与死亡、信号转导、代谢、免疫系统、胰岛素分泌、线粒体自噬（mitophagy）及中性粒细胞胞外陷阱形成等通路。转录组分析在有限的发现队列中进行，鉴于假发现风险较高，这些DEGs的识别结果应极为谨慎地解读。pCR组血浆Fas配体（Fas ligand, FASLG）、CD160及LY6/PLAUR结构域包含蛋白3（LY6/PLAUR domain containing 3, LYPD3）水平均高于non-pCR组。受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线分析显示，由FASLG、CD160和LYPD3组成的多标志物组合预测pCR的性能优于单个指标，曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.791（95%置信区间[confidence interval, CI], 0.668-0.885）。根据多标志物组合的最优截断值，所有LARC患者被分为高表达组（n=34, 55.7%）和低表达组（n=27, 44.3%）。统计分析表明，高表达组与更高比例的肠壁外血管侵犯（extramural venous invasion, EMVI）阴性状态及更高的pCR率相关。多因素分析显示，多标志物高表达与pCR独立相关。研究结论为：由FASLG、CD160和LYPD3组成的多标志物组合可作为LARC患者接受TNT治疗反应的候选预测因子，但尚需在大规模、多中心队列中进一步验证。
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其中约40%为直肠癌（rectal cancer, RC），而局部晚期直肠癌（locally advanced rectal cancer, LARC）占初诊病例的一半以上。目前LARC的标准治疗方案为新辅助放化疗（neoadjuvant chemoradiotherapy, nCRT）联合全直肠系膜切除术（total mesorectal excision, TME）。近年来多项研究表明，与nCRT相比，全量新辅助治疗（total neoadjuvant therapy, TNT）能够改善LARC患者的无复发生存期（disease-free survival, DFS）和总生存期（overall survival, OS），并提高器官保留率。部分LARC患者经TNT治疗后达到临床完全缓解（clinical complete response, cCR），可采用"观察等待"（Watch and Wait, W&W）策略。然而，少数cCR患者经TME术后病理证实并未达到病理完全缓解（pathological complete response, pCR），因此更精准地术前预测pCR对LARC患者具有重要的临床意义，有助于实现器官保留、减少手术并发症及改善生活质量，但目前尚缺乏可靠的术前pCR预测生物标志物。
血浆转录组学单独或联合蛋白质组学分析在癌症早期检测或治疗反应评估的生物标志物筛选中已显示出显著价值，但其在预测LARC患者TNT治疗反应方面的应用报道甚少。基于此背景，研究人员整合分析了LARC患者TNT治疗前血浆转录组和蛋白质组数据，并结合TME术后的病理结果，以期筛选与TNT反应相关的循环生物标志物，为术前pCR预测提供有价值的补充方法。该研究发表于《Frontiers in Oncology》。
研究人员开展的技术方法主要包括：从福建医科大学附属协和医院收集2022年1月至2024年12月期间61例LARC患者TNT治疗前、6例RA患者及6例健康参与者的血浆样本；对6例LARC患者（3例pCR vs. 3例non-pCR）进行血浆RNA测序，使用edgeR包识别DEGs，并进行基因本体论（Gene Ontology, GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）功能富集分析及基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）；采用Olink
? Target 96 Oncology II panel在61例LARC患者、6例RA患者及6例健康参与者中对部分DEGs进行蛋白质水平验证；运用ROC曲线评估单个生物标志物及多标志物组合对pCR的预测价值，并通过逻辑回归构建多标志物预测模型，采用最优截断值将患者分为高、低表达组，进行单因素和多因素分析。
DEGs分析结果显示：与non-pCR组相比，pCR组有365个DEGs上调，198个DEGs下调。GO分类显示这些DEGs参与细胞过程、代谢过程和生物调控等生物学过程，涉及结合、催化活性、分子功能调节活性、分子转导活性及转录调节活性等分子功能。KEGG分类揭示DEGs涉及多种癌症相关、信号转导、脂质代谢、能量代谢、氨基酸代谢、翻译、转录、DNA复制修复、细胞生长与死亡以及免疫系统相关通路。GO富集分析显著富集于细胞内钾离子稳态、血红蛋白代谢、内质网到细胞质的逆向蛋白质运输等通路；KEGG富集分析则显示胰岛素分泌、线粒体自噬及中性粒细胞胞外陷阱形成等通路显著富集。
DEPs及临床特征分析结果显示：基于上述DEGs的分类和通路富集分析，研究人员利用Olink
? Target 96 Oncology II panel在61例LARC患者中探索了部分DEGs的血浆蛋白水平。与non-pCR组相比，pCR组血浆FASLG、CD160和LYPD3水平更高。non-pCR组血浆FASLG水平显著低于RA患者和健康参与者，但pCR组与RA患者及健康参与者之间无显著差异；non-pCR组与RA患者及健康参与者之间血浆CD160水平无显著差异；non-pCR组血浆LYPD3水平低于RA患者，但与健康参与者无显著差异。临床病理特征分析显示，临床T分期和EMVI状态与pCR显著相关，而性别、年龄、临床N分期、直肠系膜筋膜（mesorectal fascia, MRF）状态、血浆癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）水平、肿瘤位置和肿瘤大小与TNT反应无显著相关性。
多标志物组合预测价值分析结果显示：研究人员构建了包含FASLG、CD160和LYPD3的多标志物预测模型，最终拟合的逻辑回归预测方程为：Y = ?44.3830 + (2.3447 × LYPD3) + (2.2575 × FASLG) + (0.8419 × CD160)。FASLG、CD160、LYPD3及多标志物组合的AUC分别为0.723（95%CI: 0.594–0.830, P = 0.005）、0.650（95%CI: 0.517–0.768, P = 0.059）、0.649（95%CI: 0.516–0.767, P = 0.061）和0.791（95%CI: 0.668–0.885, P < 0.001），多标志物组合预测性能最优。根据最优截断值（Y>0.2111），61例LARC患者被分为高表达组（n=34, 55.7%）和低表达组（n=27, 44.3%）。高表达组与更高比例的EMVI阴性状态及更高的pCR率相关，与性别、年龄、临床T分期、临床N1分期、MRF状态、血清CEA水平、肿瘤位置或肿瘤大小无显著相关性。
单因素和多因素分析结果显示：单因素分析中，临床T3期、EMVI阴性状态和多标志物高表达与pCR显著相关，而性别、年龄≥60岁、血清CEA水平、临床N分期、肿瘤位置、MRF状态和肿瘤大小与pCR无显著相关性。将三个统计学显著的单因素纳入多因素分析后，结果表明临床T3期和多标志物高表达与pCR独立相关。
讨论部分，研究人员首先阐述了LARC的治疗现状及TNT的应用背景，指出pCR预测对W&W策略选择的重要性。研究人员认为，PET/CT或MRI等影像学参数虽能增强pCR预测能力，但存在技术复杂、成本高等局限，因此识别简便可靠的生物学标志物至关重要。研究人员分析其队列pCR率（32.8%）略高于既往研究及大型临床试验（PROSPECT、RAPIDO、PRODIGE23、OPRA），归因于样本量较小、潜在的时间偏倚、患者选择偏倚以及放化疗方案差异等因素。
研究人员进一步讨论了发现阶段DEGs的功能意义，指出这些基因涉及免疫系统和癌症相关通路。在蛋白验证层面，研究人员确认血浆FASLG可有效区分non-pCR患者与健康参与者及RA患者，而CD160和LYPD3未显示出相同预测能力，推测可能与各组样本量不均衡有关。研究人员详细阐释了FASLG的生物学功能：作为肿瘤坏死因子超家族成员，可溶性FASLG（sFASLG）具有竞争性拮抗死亡信号、促炎介质合成、诱导肿瘤细胞凋亡及增强免疫细胞迁移能力等多重功能。pCR组LARC患者血浆FASLG水平与健康参与者相当，提示其促凋亡和抗肿瘤免疫功能相对完整，免疫微环境未受明显抑制；而非pCR组较低的FASLG水平则表明其免疫微环境可能受到抑制，这可能与其治疗反应相关。关于CD160，研究人员指出其为免疫球蛋白超家族成员，主要表达于细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤（natural killer, NK）细胞及某些T细胞亚群，具有共刺激或共抑制双重调节功能，但血浆可溶性CD160的作用尚未见报道。LYPD3作为膜锚定蛋白，在肺癌和结肠癌等多种上皮源性肿瘤细胞中高表达，参与细胞黏附和信号转导，促进肿瘤侵袭转移，但与不良预后相关，其可溶性形式在血浆中的功能同样未明。研究人员认为蛋白水平结果验证了转录组分析中DEGs参与癌症和免疫系统相关通路的发现。
研究人员强调，多标志物组合较单个标志物具有更优的pCR预测价值。低表达组中88.9%（24/27）的LARC患者未达pCR，提示该亚群可能需要探讨替代或强化治疗策略，但需前瞻性评估验证。研究人员将多标志物组合与既往报道的循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）、微小RNA（microRNA, miRNA）组合及免疫特征等预测模型进行比较，认为其区分pCR/non-pCR的性能与既往模型相当，但各模型间敏感性和特异性仍存在差异，提示继续探索更高效预测指标的价值。
研究人员还从免疫学角度探讨了研究结果的机制意义：所有LARC患者均接受CAPOX化疗（奥沙利铂和卡培他滨）联合长程放疗，而奥沙利铂和放疗均可诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD），从而激活机体免疫系统、介导抗肿瘤免疫应答。转录水平分析显示TNT治疗反应与免疫系统和癌症相关通路有关，蛋白水平进一步证实TNT治疗反应与FASLG和CD160相关的免疫系统通路以及LYPD3相关的癌症通路相关，表明免疫系统功能在LARC患者对CAPOX联合长程放化的治疗反应中发挥重要作用。
研究结论部分翻译如下：由FASLG、CD160和LYPD3组成的多标志物组合在本项探索性分析中显示出作为LARC患者TNT治疗pCR预测因子的潜力。此外，在本研究中未在蛋白水平验证的DEGs中，可能仍存在对pCR具有预测价值的分子。在考虑临床应用之前，有必要在更大规模、多中心的前瞻性队列中进行外部验证。
