《Bioengineering & Translational Medicine》：The effect of rocking speed and cell inoculation density on hepatic spheroid size: A simple method for size modulation
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研究人员利用摇床悬浮系统将原代大鼠肝细胞培养为三维球状体。在一系列摇床转速（7–18 cpm（cycles per minute，每分钟周期数））和接种密度条件下评估球状体形成情况。通过二维成像定量表征不同时间点的球状体形态。在第1、4、7、10天通过尿素和白
研究人员利用摇床悬浮系统将原代大鼠肝细胞培养为三维球状体。在一系列摇床转速（7–18 cpm（cycles per minute，每分钟周期数））和接种密度条件下评估球状体形成情况。通过二维成像定量表征不同时间点的球状体形态。在第1、4、7、10天通过尿素和白蛋白产量评估功能表现。采用体积建模评估球状体形成效率。平均球状体直径从7 cpm时的199±41 μm下降至18 cpm时的80.2±17.6 μm。球状体面积受培养天数（p<0.0001）和摇床转速的显著影响，各时间点不同转速间均存在显著差异（p<0.001，第1–7天）。10 cpm时平均球状体面积为13,750±9051 μm2（第1天）、26,730±8658 μm2（第4天），第7天降至22,526±8705 μm2。尿素产量在不同转速间存在差异（ANOVA，p=0.043），12 cpm时达到峰值（中位数3.47 μg/μg DNA），而7 cpm时较低（中位数0.11 μg/μg DNA）。白蛋白产量第1天为1086.8 ng/μg DNA，第10天为1534.4 ng/μg DNA；尿素产量第1天为0.62 μg/μg DNA，第10天为1.25 μg/μg DNA。第4天时肝细胞掺入率中位数为86%（范围73%–116%）。该摇床方法为在动态条件下生成尺寸分布可调的肝球状体提供了一种简单、低成本、可扩展的策略。该系统支持渐进性功能成熟，并与已有放大策略兼容，表明其在转化应用中具有潜力。
该研究背景在于肝源性细胞系统（包括分离肝细胞、类器官、组织切片及全器官模型）在生物人工肝（bioartificial liver，BAL）系统、肝毒理学检测和再生医学等领域需求日益增长。其中肝球状体（hepatic spheroid）作为肝细胞的三维聚集体，较单层培养能更好重现体内肝脏微环境，可维持细胞极性、细胞间通讯及肝脏特异性功能（如白蛋白和尿素合成），并具有更长存活时间与表型稳定性。球状体尺寸对其健康至关重要，过大易产生缺氧或坏死核心，因此可控且可重复的球状体尺寸调制对 reproducibility（重现性）和可扩展性十分关键。现有方法多依赖专用设备（如微模塑、悬滴、超低附着（ultra-low attachment，ULA）板、旋转瓶等），成本高或限于静态环境、难以放大， spinner flask虽低成本但剪切力较强。为此研究人员提出采用摇床（rocker）悬浮系统，通过易调参数（摇床转速、接种密度）来实现肝球状体尺寸的预测性调控，并检验其功能表现，旨在建立一套简单、低成本、可扩展的标准化制备框架。论文发表在《生物工程与转化医学》（Bioengineering & Translational Medicine）。
关键技术方法：研究人员采用8–12周龄雄性Sprague–Dawley大鼠原代肝细胞（经诺莫热灌注胶原酶分离，台盼蓝排除法测活率95%–98%，每个实验条件来自单次分离以减小批间差异），在矩形Mayo培养皿中以两种接种密度（1×106或 1.5×106cells/mL）重悬于球状体形成培养基（spheroid forming media，SFM，改良Williams E培养基）中，置于两种摇床平台（Hi-Lo Rocker与Bellco Biotechnology Rocker）上，于CO2培养箱（37°C，5% CO2）内以设定倾斜角（7°–11°）和转速（7、10、12、15、18 cpm（cycles per minute））动态培养；24小时后换用球状体培养基（spheroid culture media，SCM）；每日用Keyence BZ-X系列倒置荧光显微镜进行二维成像，测量球状体面积、长短轴、周长并由椭球几何估算体积；采用吖啶橙/碘化丙啶（acridine orange/propidium iodide）活死染色评估活力；球状体形成效率通过第4天体积建模（假定肝细胞直径17.5 μm球形）计算初始肝细胞体积掺入百分比；功能检测方面，在第1、4、7、10天分别用Quant-iT PicoGreen dsDNA检测DNA量以归一化，尿素用QuantiChrom Urea Assay Kit在无精氨酸酶Krebs–Henseleit–Hepes（KHB）缓冲液中孵育2小时测定，白蛋白用大鼠白蛋白ELISA试剂盒测定；统计用R语言进行Shapiro–Wilk正态性检验、Levene方差齐性检验、Kruskal–Wallis检验结合Mann–Whitney U事后检验，尺寸离散度用四分位变异系数（coefficient of quartile variation，CQV）评估，p<0.05为显著。
研究结果如下。
3.1 摇床转速的影响：研究人员发现除7 cpm外，所有转速下1天内均形成致密且较均匀的球状体（7 cpm需至第3天才稳定形成，部分培养皿甚至不形成）。同一转速内，球状体面积从第1天到第4天增长，第4–5天达峰值后收缩（例如10 cpm下第1天均值13,750±9051 μm2，第4天26,730±8658 μm2，第7天降至22,526±8705 μm2）；这种先增后减的趋势在12、15、18 cpm同样存在。组间比较显示培养天数（p<0.0001）和转速×天数交互（p<0.0001）对面积有显著影响，任意时间点转速越高球状体面积越小（各天p<0.001）；第7天时平均直径由7 cpm的199±41.2 μm递减至18 cpm的80.2±17.6 μm；低转速（尤其7 cpm）尺寸分布更宽（标准差更大）；CQV（四分位变异系数）初期较高（第1天可达47%），第7天稳定于21%–24%，高转速CQV相对较低。
3.2 细胞密度的影响：在固定15 cpm下，较高接种密度（1.5×106cells/mL）较低密度（1.0×106cells/mL）在各天均产生显著更大的球状体面积（p<0.05，Mann–Whitney U），且有密度×天数交互（p<0.001）；低密度下面积第1天6273±2402 μm2、第7天5627±2021 μm2，高密度下第1天7655±4951 μm2、第7天7203±3146 μm2，总体仍保持早期扩张后稳定的时序模式。
3.3 球状体形成效率：基于第4天体积建模，5组数据集的细胞掺入率为73%–116%，中位数86%（范围73%–116%），其中4组低于100%，反映多数肝细胞在day 4已有效并入球状体，侧面因成熟时球间粘连分子上调致压实、以及少量细胞黏附皿壁而造成体积估算偏差。
3.4 摇床转速对肝细胞功能（尿素与白蛋白合成）的影响：尿素/DNA表现出转速依赖性，7 cpm极低（中位数~0.11 μg/μg DNA），9 cpm升至~1.68，12 cpm最高（中位数~3.47，IQR窄），15 cpm降至~1.72（变异增大），18 cpm~1.02；7 cpm显著低于9、12 cpm（p<0.05），其余转速间无统计差异；灭活对照近零证实 assay特异性。功能随时间进展：在9 cpm下白蛋白/DNA中位数从第1天1086.8 ng/μg DNA（IQR 976.2–1528.2）到第7天1545.8（IQR 1174.1–1803.5）、第10天1534.4（IQR 1442.6–1962.8）；尿素/DNA从第1天0.6209 μg/μg DNA（IQR 0.523–0.731）到第7天1.0996（IQR 0.691–1.379）、第10天1.2538（IQR 0.845–1.398）；第4到7天两项指标均有显著上升（p<0.05或p<0.01），符合功能成熟趋势。
讨论部分总结：研究人员指出摇床转速与接种密度对球状体尺寸的简单调控关系成立——更高转速因增强剪切力和减少肝细胞聚集接触时间而产生更小球状体，更低转速（≥10 cpm）允许更大尺寸但过低（7 cpm）致形成不一致甚至失败（可能动能不足）；接种密度高则提升细胞互作概率进而增大球状体尺寸。尺寸先增后减的时序模式归因于早期细胞聚集生长与后续成熟过程中细胞间连接成熟、细胞骨架重塑导致的压实（compaction）。中等转速（9–12 cpm）代谢功能最优，过低致扩散限制（大球状体易缺氧），过高致剪切干扰细胞间连接（如cadherin介导）或整合素–ECM互作且可能削弱细胞间信号，从而功能下降；但本研究未直接验证这些机制。效率体积建模示day 4中位86%掺入，偏低值可能与皿壁细胞黏附及压实后直径→体积换算低估真实细胞数有关。功能上白蛋白/DNA换算至每百万细胞每天约7.0 μg（day 4）和9.1 μg（day 7），高于文献静态二维（~1.5–2.5 μg/百万细胞/天），尿素/DNA缩放至24小时逾15 μg/μg DNA（day 7），也高于文献二维肝细胞，表明摇床球状体功能增强；但DNA–细胞数换算假设二倍体6 pg DNA/肝细胞未考虑大鼠肝细胞多倍体，需谨慎解读。局限性包括仅用大鼠原代肝细胞（种属差异限制直接推广到人源肝细胞、hiPSC（human induced pluripotent stem cell）衍生肝细胞或HepaRG等），二维测量假定椭球可能偏差（建议未来3D成像验证），未评估>7天长期存活与结构，尺寸变异较ULA/微井系统宽（但day 7 CQV 21%–24%仍在BAL等可接受范围），且摇床参数与仪器倾斜角/运动曲线有关（但两平台经cpm与倾角匹配可得可比尺寸分布，说明主要受可调培养参数而非特定设备支配，其他实验室需轻微校准）。结论翻译：提高摇床转速会减小球状体尺寸，而更高接种密度会增大之。本研究提出了一种可通过两个易控参数（摇床转速与细胞接种密度）精细调节肝球状体尺寸的 reproducible（重现性）且 scalable（可扩展）的方法。纳入聚焦功能评估表明，通过摇床转速调制球状体尺寸具有生物学意义，中等摇床转速下观察到归一化至DNA含量的尿素与白蛋白产量最高。此类标准化对提升三维肝培养一致性以及优化其在冷冻保存、生物人工肝系统与肝细胞检测中的应用至关重要。总之结果可为后续针对转化用途的球状体质量与应用特定功能表现优化奠定基础；通过建立简单、可调且无需专用设备即可重现控制球状体尺寸的参数为肝球状体系统标准化与转化应用提供实用且可扩展的策略。
