《Advanced Science》：TSPYL5 Promotes Triple-Negative Breast Cancer Metastasis by Antagonizing USP10-Mediated PTEN Stabilization to Unleash a ZEB1-Dependent EMT Program
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磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路的高活化是转移性三阴性乳腺癌（TNBC）的标志，但在保留野生型PTEN的TNBC中，该通路的驱动因素尚不清楚。研究人员通过无偏生物信息学筛选发现睾丸特异性Y样蛋白5（TSPYL5）——排名最高的转移相关基
磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路的高活化是转移性三阴性乳腺癌（TNBC）的标志，但在保留野生型PTEN的TNBC中，该通路的驱动因素尚不清楚。研究人员通过无偏生物信息学筛选发现睾丸特异性Y样蛋白5（TSPYL5）——排名最高的转移相关基因——是解决这一悖论的主调控因子。临床上，TSPYL5扩增和过表达是转移进展和不良预后的稳健预测因子。高分辨率单细胞和空间分析揭示，TSPYL5定义了一群具有干性特征、基因组不稳定性和促转移特性的恶性亚群。功能上，TSPYL5足以驱动原位肿瘤的自发性多器官转移，且对侵袭后定植不可或缺，最终导致60%的动物出现明显肝转移——而对照组无此表型。机制上，TSPYL5螯合去泛素化酶USP10，从而阻止其稳定肿瘤抑制因子PTEN。这一TSPYL5-USP10相互作用触发PTEN的蛋白酶体降解，绕过其野生型状态以过度激活PI3K/AKT信号并释放ZEB1驱动的转移程序。该研究阐明了一条完整的TSPYL5-USP10-PTEN轴，为TNBC中转录后肿瘤抑制因子失活提供了新范式。研究证实TSPYL5是PI3K通路依赖性的生物标志物，并确立TSPYL5-USP10界面为恢复PTEN功能和对抗转移性TNBC的可成药性治疗靶点。
三阴性乳腺癌（TNBC)是乳腺癌中最具侵袭性的亚型，占所有乳腺癌病例的10%–20%。由于缺乏可靶向的激素受体和人表皮生长因子受体2（HER2)，TNBC的治疗长期依赖传统化疗，但化疗耐药频繁发生，转移性TNBC的5年生存率仅约12%。PI3K/AKT通路是TNBC中最常出现高活化的信号轴之一，然而一个长期存在的悖论是：这种高活化往往发生在保留野生型PTEN的肿瘤中，提示存在PTEN蛋白去稳定的非遗传学机制，但调控该过程的关键上游因子在TNBC中 largely 未知。同时，TNBC转移依赖上皮-间充质转化（EMT)等细胞可塑性程序，而启动和维持ZEB1依赖性EMT程序的具体信号事件尚未完全阐明。是否存在共同的上游调控因子协调PTEN稳定性与EMT等促转移程序的诱导，成为一个关键未解问题。基于此背景，研究人员开展了本项研究，相关成果发表于《Advanced Science》。
研究人员首先通过对乳腺癌样本进行无偏生物信息学筛选，发现TSPYL5是排名最高的转移相关基因。为验证TSPYL5的临床相关性，研究人员分析了多个大型独立乳腺癌患者队列，证实TSPYL5高表达与较短的总生存期（OS)、无远处转移生存期（DMFS)和无复发生存期（RFS)显著相关。在TCGA-BRCA队列中，TSPYL5表达在基底样乳腺癌（BLBC)中最为富集，且高TSPYL5表达与BLBC患者较短的OS显著相关。单细胞RNA测序分析显示，TSPYL5表达主要定位于TNBC样本的细胞中，在ER+或HER2+肿瘤中明显较低。研究人员进一步对本中心的120例TNBC组织微阵列（TMA)进行免疫组织化学（IHC)分析，证实TSPYL5蛋白在肿瘤组织中显著升高，且随临床分期进展呈进行性增加。基因组分析表明，TSPYL5在7%–20%的乳腺癌队列中存在扩增，且与较高的肿瘤组织学分级、基底样亚型富集及更高死亡率相关。这些多维度数据共同揭示TSPYL5主要在侵袭性TNBC亚型中富集，与高复发和转移风险相关。
为解析TSPYL5在TNBC中的细胞学基础，研究人员利用单细胞分析发现TSPYL5表达主要定位于上皮细胞区室。通过copyKAT算法将上皮细胞区室分为恶性（非整倍体）和正常（二倍体）群体后，分析显示TSPYL5阳性细胞在恶性群体中显著富集（18.7% vs. 3.2%）。空间转录组学分析证实TSPYL5表达与恶性上皮细胞特征原位共定位，且InferCNV分析显示高TSPYL5表达的上皮区域具有显著升高的拷贝数变异（CNV)评分，将TSPYL5表达与基因组不稳定性这一关键促转移特征联系起来。
功能研究方面，研究人员在MDA-MB-231细胞中过表达TSPYL5，证实其显著促进细胞增殖、克隆形成、G1/S期转换、DNA合成、侵袭和迁移能力，并增强对紫杉醇和γ-放疗的抵抗性；反之，在高表达的HCC38细胞中通过CRISPR/Cas9敲除TSPYL5则产生相反效应。体内研究中，原位移植模型显示TSPYL5过表达显著促进原发肿瘤生长并伴随多器官自发转移；尾静脉实验转移模型进一步揭示TSPYL5促进侵袭后定植阶段，8周时60%的TSPYL5过表达小鼠出现明显肝转移，而对照组无此表型。TSPYL5敲除的BT-549细胞则表现出原发肿瘤生长和肺转移定植的显著抑制。
分子机制解析中，RNA测序和基因集富集分析（GSEA)表明TSPYL5在细胞水平和肺转移灶中均显著富集EMT通路。西方国家印迹证实TSPYL5过表达导致间充质标志物（ZEB1、FN1、N-cadherin)上调和上皮标志物E-cadherin下调。TCGA-BLBC队列中TSPYL5表达与EMT通路评分及ZEB1 mRNA表达显著正相关。功能挽救实验证实ZEB1敲除可逆转TSPYL5诱导的EMT表型和促迁移侵袭能力，而ZEB1过表达可恢复TSPYL5敲除细胞的侵袭迁移能力，确立TSPYL5-ZEB1依赖性EMT调控轴。
上游信号通路探索中，KEGG通路分析锁定PI3K-AKT-mTOR通路为TSPYL5的核心下游。西方国家印迹证实TSPYL5过表达增加PI3K、AKT和mTOR的磷酸化活化，且该效应具有特异性——不影响Wnt/β-catenin、TGF-β、ERK或IL6/STAT3等其他经典EMT调控通路。药理学实验表明PI3K抑制剂（LY294002)、AKT抑制剂（MK-2206)和mTOR抑制剂（Rapamycin)均可挽救TSPYL5诱导的EMT表型和促迁移侵袭能力。体内实验中，MK-2206治疗可有效将TSPYL5增强的肺转移定植恢复至对照水平。
为阐明TSPYL5激活PI3K-AKT通路的具体分子机制，蛋白质-蛋白质相互作用（PPI)网络分析将PTEN锁定为连接TSPYL5与AKT通路的关键枢纽。研究发现TSPYL5过表达降低PTEN蛋白水平而不影响其mRNA水平，放线菌酮（CHX)追踪实验显示TSPYL5显著缩短PTEN半衰期，蛋白酶体抑制剂MG132可阻断该效应；共免疫沉淀实验证实TSPYL5增加PTEN多泛素化水平。进一步研究中，研究人员将去泛素化酶（DUB) USP10确定为TSPYL5的作用靶点：共免疫沉淀证实TSPYL5与USP10、USP10与PTEN均存在相互作用，但三者不形成稳定的三元复合物；竞争性共免疫沉淀显示TSPYL5直接置换USP10结合的PTEN；体外去泛素化实验证实TSPYL5抑制USP10的酶活性。USP10敲除可消除TSPYL5过表达对PTEN/PI3K/AKT/ZEB1轴的进一步调控作用，而USP10或PTEN的外源表达均可挽救TSPYL5驱动的细胞侵袭迁移能力。结构域映射实验和分子对接模拟揭示TSPYL5和PTEN均与USP10的C末端区域（氨基酸400–797)结合，形成竞争性结合界面。临床样本验证中，110例TNBC组织微阵列的IHC分析显示TSPYL5表达与p-AKT、ZEB1水平正相关，与PTEN蛋白水平负相关。
讨论部分，研究人员总结指出：TSPYL5不仅作为生物标志物，更是定义特定恶性细胞状态的关键决定因子，其所标记的细胞群体具有肿瘤干细胞（CSC)样表型、促转移转录程序和基因组不稳定性的"危险三联征"；研究阐明的TSPYL5-USP10-PTEN-AKT-ZEB1层级级联为理解TNBC转移提供了完整的信号轴，其中竞争性拮抗USP10导致PTEN功能性失活的机制尤为新颖；针对TSPYL5-USP10蛋白质-蛋白质相互作用（PPI)开发小分子抑制剂可望恢复PTEN的肿瘤抑制功能，代表了TNBC治疗的新策略。研究结论指出：研究人员已鉴定TSPYL5为TNBC中的关键致癌驱动因子，解析了从基因扩增到转移编程的完整信号级联，该级联以一种新颖的DUB拮抗机制为中心导致PTEN功能性缺失，这些发现为TNBC侵袭性提供了新的分子解释，并 crucially 揭示TSPYL5-USP10界面作为恢复肿瘤抑制和对抗这一毁灭性转移疾病的 prime 治疗靶点。
研究中采用的主要关键技术方法包括：基于公共数据库（TCGA、GEO、KMplotter、CCLE)的生物信息学和队列分析；单细胞RNA测序（scRNA-seq)数据分析（Seurat、Harmony、copyKAT、CytoTRACE)和空间转录组学分析（10× Genomics Visium、CARD、InferCNV)；慢病毒介导的基因过表达和CRISPR/Cas9基因敲除技术；细胞功能学实验（增殖、克隆形成、细胞周期、迁移、侵袭、凋亡检测)；原位移植和尾静脉注射动物模型；RNA测序和GSEA/KEGG通路分析；共免疫沉淀、竞争性结合和体外去泛素化酶活性测定；组织微阵列免疫组织化学分析和相关性统计。
