纳利迪克酸（Nalidixic Acid）对抗假结核分枝杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）抗菌效果的结构学、蛋白质组学和代谢组学研究

《Microbial Pathogenesis》：Structural, Proteomic, and Metabolomic Insights into the Antibacterial Efficacy of Nalidixic Acid against Corynebacterium pseudotuberculosis

作者名单：Anati Abd Rashid Syaida、Mohd Izwan Mohammad Yusof、Faez Firdaus Abdullah Jesse、Mohd Salleh Rofiee、Mohd Fakharul Zaman Raja Yahya

马来西亚雪兰莪州沙阿兰市MARA科技大学应用科学学院，邮编40450

摘要

Corynebacterium pseudotuberculosis是一种兼性细胞内病原体，可引发干酪样淋巴结炎，这种疾病给畜牧业带来了巨大的经济损失。尽管已证实萘啶酸（NA）能够抑制C. pseudotuberculosis的生物膜形成，但其作用机制仍不明确。本研究旨在探讨NA在有效浓度下对C. pseudotuberculosis的结构、蛋白质组学和代谢组学的影响。实验测定了NA对浮游菌的最小抑制浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。通过观察生物膜形成、结晶紫染色（生物量测定）和重氮紫染色（代谢活性检测）来评估其抗生物膜效果。利用场发射扫描电子显微镜（FESEM）观察生物膜结构，并通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析其生化组成。蛋白质组学分析采用SDS-PAGE结合HPLC-MS/MS技术，代谢组学分析则使用UPLC/Q-TOF-MS技术。实验结果显示，NA的MIC为12.5 μg/mL，MBC为100 μg/mL。NA能够抑制生物膜形成，并显著降低生物膜生物量和活性（p < 0.05）。在100 μg/mL浓度下，FESEM观察到生物膜结构几乎完全破坏，FTIR光谱也证实了生化组成的改变。蛋白质组学分析显示，参与能量产生（AtpA、AtpD）、翻译（核糖体蛋白）和氨基酸代谢（GlyA）的关键蛋白表达发生差异。代谢组学分析发现118种代谢物显著失调，表明碳代谢系统受到严重影响，尤其是三羧酸（TCA）循环。综合蛋白质组学和代谢组学分析表明，NA在C. pseudotuberculosis的生物膜形成过程中引发了系统性紊乱。

引言

生物膜是由微生物组成的群体，它们不可逆地附着在生物或非生物表面，并被自身产生的胞外聚合物（EPS）基质包裹。与浮游菌相比，生物膜具有独特的代谢活动、基因表达、生长速率和蛋白质合成特征。EPS基质对生物膜的形成至关重要，因为它提供了机械稳定性和化学复杂性，使微生物能够抵抗抗菌剂和宿主免疫系统的攻击。成熟的生物膜还具有粘弹性，能够通过变形而非脱落来承受流体剪切应力，从而实现持续定植和多重耐药性。

在形成生物膜的病原体中，Corynebacterium pseudotuberculosis是一种革兰氏阳性、多形性的兼性细胞内细菌，属于CMNR群（Corynebacterium、Mycobacterium、Nocardia、Rhodococcus），在兽医和人畜共患病领域具有重要意义。这种非运动性的β-溶血性病原体是反刍动物（尤其是绵羊和山羊）干酪样淋巴结炎（CLA）的致病菌。CLA导致生产力下降、胴体废弃和高死亡率，造成重大经济损失。此外，C. pseudotuberculosis还与溃疡性淋巴管炎、乳腺炎和溃疡性皮炎等感染有关，进一步凸显了其对动物健康和农业经济的严重影响。

鉴于生物膜的持久性和对抗传统疗法的耐受性，抗菌剂仍是治疗这些感染的关键。NA是1963年首次用于临床的喹诺酮类抗生素，其作用机制是抑制细菌DNA旋转酶，从而干扰DNA复制和合成。其结构特征是在1,8-萘啶核的2,3位含有α,β-不饱和羧酸。虽然最初对尿路感染有效，但由于Salmonella、Staphylococcus、Pseudomonas、Proteus和Escherichia等病原体迅速产生耐药性，其临床应用受到限制。然而，NA作为喹诺酮类的先驱，仍具有重要的历史和药理学价值，仍是治疗多种细菌感染的重要选择。

NA对生物膜形成的影响及其在抗生物膜相关感染中的应用已得到广泛研究。Chadha和Khullar的研究表明，亚抑制浓度（sub-MIC）的NA可显著改变E. coli的生长速率和生物膜形成。具体而言，sub-MIC的NA可降低细菌运动性并诱导外膜蛋白（OMPs）的表达，而这些蛋白对生物膜形成至关重要。将NA与其他抗菌剂（如抗菌肽Cecropin A，CecA）联合使用，可有效清除尿路致病E. coli形成的生物膜，且无细胞毒性。此外，NA处理显著降低了该细菌生物膜的活性（p < 0.05），提示其在CLA治疗中的潜在应用。然而，NA对抗C. pseudotuberculosis的抗菌机制仍不明确。因此，本研究旨在评估NA对C. pseudotuberculosis的抑制作用，并分析NA处理后其生物膜的结构、蛋白质组和代谢组学变化。

章节摘录

测试化合物

根据制造商说明制备了NA的储备溶液（Sigma – Aldrich，美国）。随后进行两倍系列稀释，得到3.12 μg/mL至100 μg/mL的浓度范围用于抗菌测试。

测试微生物

从马来西亚普特拉大学（UPM）兽医医学院的兽医病理学和微生物学系获得了C. pseudotuberculosis的临床分离株。该分离株在37°C的营养肉汤中培养和维持。

最小抑制浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）

测定了NA对浮游C. pseudotuberculosis的MIC和MBC。MIC定义为24小时培养后未观察到生长的最低浓度，为12.5 μg/mL（图1A）。MBC为导致初始接种物99.9%杀死的最低浓度（表现为MHA平板上无生长），为100 μg/mL（图1B）。

讨论

C. pseudotuberculosis引起的干酪样淋巴结炎是一种慢性致残性疾病，治疗选择有限。受感染动物的脓肿中含有耐药于传统抗生素的生物膜样细菌群落。通过结合表型分析、蛋白质组学和代谢组学研究，我们深入了解了导致生物膜崩溃的系统性机制。

结论

总之，研究表明NA不仅抑制生物膜的活性和生物量，还破坏了其保护性结构，FESEM和FTIR光谱显示生物膜基质和结构几乎完全丧失。综合蛋白质组学和代谢组学分析表明，NA导致碳代谢系统（尤其是TCA循环）的崩溃，同时影响相关核心蛋白的表达。

CRediT作者贡献声明

Mohd Salleh Rofiee：撰写、审稿与编辑、软件使用、方法学设计。Mohd Fakharul Zaman Raja Yahya：撰写、审稿与编辑、验证、监督。Anati Abd Rashid Syaida：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据分析。Mohd Izwan Mohammad Yusof：撰写、审稿与编辑、数据可视化、监督、软件使用。Faez Firdaus Abdullah Jesse：撰写、审稿与编辑、资源提供。

声明与披露

本手稿为作者的原创成果，未在其他地方发表或部分发表。作者声明与本文的发表无利益冲突。

手稿制备过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在撰写过程中，作者使用了DeepSeek工具来纠正拼写和语法错误。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。

资助

本研究由马来西亚高等教育部资助，项目编号为600-IRMI/FRGS 5/3（417/2019）。

利益冲突声明

? 作者声明以下财务利益或个人关系可能构成潜在的利益冲突：Mohd Fakharul Zaman Raja Yahya表示获得了马来西亚高等教育的财务支持。其他作者声明没有可能影响本文研究的财务利益或个人关系。