在过去三十年中，研究表明非编码小RNA（miRNA）分子在基因表达中起着重要作用，并在细胞生长、发育和凋亡中发挥关键作用。1, 2 此外，临床研究表明miRNA的异常表达与多种疾病密切相关，尤其是恶性肿瘤。3, 4 例如，miRNA-21在11种实体瘤中过表达，包括胃癌、前列腺癌和乳腺癌。5, 6 此外，某些miRNA在血清、唾液和尿液等体液中的显著稳定性使其成为早期分类、诊断和预后的非侵入性生物标志物。7, 8, 9 尽管具有这些潜力，但由于miRNA序列较短、丰度低且序列同源性高，其检测仍然具有技术挑战性。10, 11
尽管Northern blotting被广泛认为是miRNA检测的金标准，但它既费时又繁琐。然而，定量聚合酶链反应（qPCR）往往无法可靠地定量非常低丰度的目标。12, 13, 14 相比之下，电化学生物传感器提供了快速、低成本且用户友好的平台，非常适合临床应用。15, 16, 17 然而，传统的单信号设计容易受到界面微环境干扰的影响，从而影响重复性。18, 19 比率电化学传感器通过测量两个独立氧化还原信号的比例来定量目标，从而提高了稳定性和鲁棒性。20, 21, 22, 23, 24 然而，大多数一维比率电化学DNA传感器常常受到探针缠结、随机取向和目标访问受限的影响，限制了其灵敏度和动态范围。25, 26, 27, 28 自DNA折纸技术出现以来，DNA纳米技术的发展催生了多种三维（3D）结构。29, 30, 31 其中，作为FNA的代表，四面体DNA纳米结构（TDN）结合了优异的生物相容性、可编程组装和精确的空间配置，使其在生物传感和生物医学应用中具有吸引力。32, 33, 34, 35 Chen等人基于TDN结构构建了一种电化学生物传感器，并通过链置换扩增实现了对端粒酶活性的敏感检测。36 在典型的基于TDN的电化学传感器中，三个顶点将四面体固定在电极表面，而另一个顶点则作为识别探针。尽管TDN提高了探针在电极表面的可访问性，但其结构框架的低效利用限制了材料效率，从而增加了制造成本。37, 38, 39
为了克服许多生物标志物固有的低丰度挑战，无酶等温扩增策略（如toehold介导的链置换（TMSD）与杂交链反应（HCR）或催化发夹组装（CHA）相结合，提供了模块化、低成本的信号增强方法。40, 41 与单步信号扩增策略相比，级联扩增架构在检测低丰度目标时表现出更高的灵敏度。Zhou等人通过在四面体DNA纳米结构（TDN）上集成滚环扩增（RCA）和杂交链反应（HCR），实现了对两种肝癌相关microRNA的同时敏感检测和细胞内成像。42 最近，凸起环这种具有类似茎环动力学稳定性的不对称核酸内部环结构已被用于TMSD过程。43, 44, 45 然而，单阶段扩增通常无法达到临床诊断所需的灵敏度，因此需要开发级联扩增策略。传统的级联反应依赖于DNA探针的随机扩散和碰撞，这限制了反应效率。46 因此，迫切需要结合高灵敏度、鲁棒性和定量准确性的电化学比率传感器。
在这里，我们报道了一种基于TDN框架的可重构电化学比率传感器，整合了凸起环介导的CHA-HCR级联反应，以精确和敏感地检测miRNA，以miRNA-21作为概念验证。如图1a所示，发夹H1首先与其他三条链组装成完整的TDN（H-TDN），然后通过Au-S键固定在电极表面。一侧边缘设计的凸起环替代了传统的CHA发夹，既提供结构支持又具有扩增功能。当miRNA-21结合时（图1b），发夹H1打开并与相邻的凸起环发生链置换反应，重新配置TDN并挤出报告基因链，触发下游的HCR。在整个反应过程中，燃料链回收目标并将废物链重新整合到TDN重构中，确保亚甲蓝参考探针（MB-rP）在刚性的TDN框架内稳定定位。这种固定的取向使rP能够忠实反映电极界面的任何微环境变化，显著提高了测量的准确性和重复性。通过测量稳定的rP与新生成的铁氰化物信号探针（sP）的比例，可以高精度地定量miRNA-21。总之，这种新型的可重构、基于框架的电化学比率传感器为生物标志物检测提供了一种具有改进准确性和灵敏度的设计范例，同时也为基于框架的架构的功能应用提供了新的视角。
