构建基于聚集诱导发光原（AIEgen）并整合CRISPR/Cas9的平台以重塑肿瘤微环境并增强抗胶质母细胞瘤的光免疫治疗

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Engineering an AIEgen-based platform integrating CRISPR/Cas9 to remodel the tumor microenvironment and reinforce photo-immunotherapy against glioblastom

胶质母细胞瘤仍是最致命的脑肿瘤之一。尽管免疫治疗与其他治疗模式在若干恶性肿瘤中取得显著疗效，但其在胶质母细胞瘤中的疗效仍受限，主要归因于复杂的肿瘤微环境（TME）以及血脑屏障（BBB）等生理屏障。在此背景下，纳米医学与基因编辑因具备跨越BBB并通过固有理化性质保护治疗剂的独特能力而成为有前景的策略。为克服生理屏障以获得更好疗效，研究人员合成了一种新型聚集诱导发光原（AIEgen）NDA-DPE，其通过限制分子内运动表现出近红外一区（NIR-I）至近红外二区（NIR-II）荧光以及光热（PTT）与光动力（PDT）双重性质。随后通过将NDA-DPE与CRISPR/Cas9介导的CD73基因沉默相整合，制备了骨源中性粒细胞基仿生纳米颗粒（bNe@AIE/Cas9-CD73）。中性粒细胞的包被使体系能够高效穿透BBB并靶向蓄积于胶质母细胞瘤组织。CRISPR/Cas9-CD73下调CD73表达，破坏ATP–腺苷轴，并将免疫抑制性TME重塑为免疫支持型，提高肿瘤细胞的治疗敏感性。在NIR-II激发下，bNe@AIE/Cas9-CD73实现荧光引导的PTT与PDT，诱导免疫原性细胞死亡（ICD），刺激免疫细胞招募并激活系统性抗肿瘤免疫。bNe@AIE/Cas9-CD73展现出强效的基因–光热–光动力–免疫协同效应，显著抑制胶质母细胞瘤生长，为有效且靶向的胶质母细胞瘤治疗建立了有前景的纳米平台。

研究背景：胶质母细胞瘤是人类最常见且致死性最高的原发性恶性脑肿瘤，具有高度异质性、浸润性与侵袭性，目前中位总生存期不足15个月。现有手术、化疗、放疗及肿瘤靶向治疗等进步显著，但仍受限于免疫特权的中枢神经系统（CNS）特征、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）、血脑屏障（BBB）及血脑肿瘤屏障（BBTB），导致治疗抵抗强、疗效差。免疫治疗虽为新兴策略，但CNS静息免疫状态、髓系细胞活性及适应性耐药使超50%患者获益有限；“冷”肿瘤向“热”肿瘤转化成为提升疗效的关键方向。CD73（由NT5E基因编码）作为缺氧诱导的外核苷酸酶，催化AMP生成腺苷与磷酸，通过ATP–腺苷轴促进免疫抑制TME、血管生成及治疗抵抗，是胶质母细胞瘤免疫联合治疗的重要靶点。聚集诱导发光原（AIEgen）因聚集态发光增强、光稳定性高、兼具光热（PTT）与光动力（PDT）性能及NIR-II荧光成像能力，适合深部脑肿瘤诊疗。CRISPR/Cas9可实现精准基因编辑以下调CD73，但体内高效递送与BBB穿透仍是瓶颈。研究人员在《Signal Transduction and Targeted Therapy》（《信号转导与靶向治疗》）上发表本研究，旨在整合AIEgen多模式诊疗、CRISPR/Cas9基因编辑与仿生中性粒细胞递送，克服BBB/TME屏障，重塑ATP–腺苷轴与免疫微环境，实现协同基因–光–免疫抗胶质母细胞瘤治疗。

主要关键技术方法：研究人员合成新型D–π–A结构AIEgen（NDA-DPE）并封装为AIE dots；设计NT5E靶向sgRNA构建px458-CRISPR/Cas9-CD73质粒，以PEI₄₀₀₀₀形成复合体后与AIE dots组装；从C57BL/6 J小鼠骨髓分离并鉴定骨源中性粒细胞（bNe），通过共孵育制备bNe@AIE/Cas9-CD73仿生纳米平台；采用正交原位GL261及GL261-Luc胶质母细胞瘤C57BL/6 J模型评估体内靶向、NIR-II成像、PTT/PDT疗效、基因编辑效率、TME免疫重塑（流式、ELISA、WB、H&E等）及生物安全性（血常规、血生化、主要器官病理）。

研究结果：

Synthesis and characterization of AIEgen：研究人员通过理论计算（DFT）与光谱表征证实NDA-DPE具D–π–A结构、HOMO/LUMO分离与分子内电荷转移（ICT）特性；AIE dots在水分散体系中表现强AIE效应、NIR-I至NIR-II发射（峰值~1110 nm）、808 nm高吸收优于吲哚青绿（ICG），光稳定性优于ICG；粒径约114 nm，适合生物医学应用。

Phototherapy properties evaluation of NDA-DPE in vitro：研究人员发现NDA-DPE溶液在808 nm激光（0.5 W/cm²）下温度剂量依赖上升，最高达71.6 ℃，光热循环稳定优于IR780；能高效产生单线态氧（¹O₂）、羟基自由基（•OH）而不产超氧阴离子；808 nm激光可穿透数毫米脑组织对深部NDA-DPE溶液有效光热转化，证明适宜体内光诊疗。

Synthesis and characterization of bNe@AIE/Cas9-CD73：研究人员筛选得到最优px458-CRISPR/Cas9-CD73（二号sgRNA）可有效敲减NT5E（CD73）；骨源中性粒细胞经形态与表面标志物（CLM-5、Ly-6G/Ly-6C）鉴定合格；AIE dots–PEI₄₀₀₀₀–质粒复合体被中性粒细胞内吞（主要经由脂筏介导内吞），负载效率约54.28%，基因负载量约41.60%；TEM/CLSM/UV–Vis/荧光证实复合体定位于中性粒细胞胞质，酸性与炎症环境下 cargo释放增加；体外GL261细胞处理显示bNe@AIE/Cas9-CD73引起NT5E基因indel、CD73蛋白下调约至对照25.09%，EGFP标签示踪转染效率约52.90%。

Cell uptake, subcellular localization, cytotoxicity, and inflammation-active penetration across the BBB in vitro：研究人员发现bNe@AIE/Cas9-CD73被GL261细胞摄取效率与PEI₄₀₀₀₀对照组相当，炎症（fMLP诱导）下显著增强；NDA-DPE主要定位于溶酶体与线粒体（Pearson系数分别0.99、0.81）；AIE dots暗毒性低（100 μg/mL时细胞活力>80%）；体外BBB模型（bEnd.3单层）中bNe组荧光透过量较游离AIE dots高3.53倍，炎症下再提升1.81倍，证明炎症趋化介导的高效BBB穿透。

Efficient targeted phototherapy against glioblastoma cells in vitro：研究人员证实808 nm激光下AIE dots产ROS（DCFH-DA探针），CRISPR/Cas9-CD73敲减进一步增强PDT效果；bNe@AIE/Cas9-CD73＋L组细胞凋亡/坏死最显著，炎症条件下杀伤更强；诱导免疫原性细胞死亡（ICD）标志（HMGB1、Calreticulin、cGAS–STING上调），促进树突状细胞（DC）成熟、M1型巨噬细胞极化；T细胞共培养上清TNF-α、IFN-γ显著升高；ATP、ADP、AMP蓄积而腺苷、磷酸降低，证实CD73阻断ATP→腺苷＋磷酸轴，逆转免疫抑制。

Evaluation of bNe@AIE/Cas9-CD73 tumor targeting：研究人员通过体内NIR-II成像发现bNe@AIE/Cas9-CD73在注射后48 h脑肿瘤部位荧光最强，96 h消退，远优于游离AIE dots；离体脏器显示肿瘤富集最高，肝肺次之，脾富集低于AIE dots（减少RES清除）；体内半衰期延长至5.92 h（NDA-DPE 0.93 h，AIE dots 2.23 h）；瘤组织CD73蛋白显著下调；体内肿瘤相关巨噬细胞CD73敲减不明显但瘤组织整体CD73降低，证明靶向基因编辑有效。

Evaluation of bNe@AIE/Cas9-CD73 amplified synergistic antitumor effect in vivo：研究人员在正交GL261-Luc模型中发现，注射48 h后808 nm激光（0.5 W/cm²，5 min）使bNe@AIE/Cas9-CD73组瘤温升至59.8 ℃（对照组仅~34 ℃），体内PDT ROS生成最强；bNe@AIE/Cas9-CD73＋L组 bioluminescence信号抑制最显著，单一bNe@CRISPR/Cas9-CD73或bNe@AIE dots有一定抑瘤效果，bNe@AIE dots＋L中等，对照组及单独激光无效；生存曲线示bNe@AIE/Cas9-CD73＋L与bNe@CRISPR/Cas9-CD73＋L显著延长存活；H&E示瘤区坏死、结构破坏；体重无严重波动，示安全性好。

讨论部分总结：研究人员指出胶质母细胞瘤疗效受限核心是TME与BBB/BBTB屏障；CD73高表达催化ATP→腺苷＋磷酸轴促免疫抑制、酸性TME、M2巨噬极化与治疗抵抗；CRISPR/Cas9靶向NT5E可阻断该轴，升高ATP/ADP/AMP，降低腺苷/磷酸，解除腺苷介导的A_2AR等抑制，提升pH促进M1极化，并可能激活cGAS–STING通路增强免疫；NDA-DPE作为AIEgen具NIR-II成像、强PTT（光热转换）与PDT（¹O₂、•OH）性能，诱导ICD释放ATP等危险信号，与CD73阻断协同重塑“冷”至“热”TME；仿生骨源中性粒细胞利用炎症趋化与免疫逃逸特性高效跨BBB、靶向瘤区、降低RES清除、延长循环；体内证实bNe@AIE/Cas9-CD73＋L协同基因编辑、PTT、PDT提升DC成熟、M1巨噬、CD4⁺/CD8⁺T细胞、NK细胞浸润及TNF-α、IFN-γ升高，瘤内ATP蓄积、腺苷降低；安全性评价示NT5E部分敲减在主要脏器无显著病理、血气、肝肾功能及炎性因子异常，治疗剂量下全身毒性低；局限在于体内巨噬细胞基因编辑效率偏低、质粒/纳米材料中性粒细胞负载量、体外中性粒细胞寿命短、潜在CRISPR脱靶需进一步优化；结论为：研究人员构建了整合AIEgen NDA-DPE、CRISPR/Cas9-CD73与仿生中性粒细胞递送的bNe@AIE/Cas9-CD73平台，通过BBB穿透、瘤靶向、CD73阻断ATP–腺苷轴重塑免疫支持TME，联合NIR-II引导PTT/PDT诱导ICD，实现基因–光热–光动力–免疫协同强效抑制胶质母细胞瘤，为精准诊疗提供了新范式。