CytoSignal从空间转录组数据中以细胞分辨率检测配体-受体信号的位点与动态变化

《Nature Genetics》：CytoSignal detects locations and dynamics of ligand–receptor signaling at cellular resolution from spatial transcriptomic data

　　

摘要 细胞通过配体-受体（Ligand–Receptor, LR）信号互作进行通讯，但识别这些互何在、何时活跃仍具挑战。研究人员开发了CytoSignal，用以从空间转录组数据中推断细胞分辨率的细胞-细胞通讯位点与动态。研究表明，这种细胞分辨率、空间分辨的信号评分可实现若干重要分析——识别信号强度的空间梯度、量化接触依赖性与可扩散互作的位点、检测信号相关基因，以及识别多样本数据间的差异信号。此外，研究人员可预测各空间位点上信号互作的时序动态。研究人员通过原位邻近连接 assay（Proximity Ligation Assay, PLA）对结果进行实验验证，证实CytoSignal比既往方法更准确地预测LR互作位点。本研究回应了领域对一种稳健、可扩展工具的需求，可从空间转录组数据中以细胞分辨率检测细胞-细胞信号互作及其动态。

论文解读

研究背景

细胞间信号通讯多通过分泌配体结合跨膜受体或膜蛋白在相邻细胞二聚化等机制实现，其在正常发育中的细胞分化与命运决定、成体生物免疫应答、生长及生理组织功能协调中扮演核心角色。传统单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq）可揭示异质组织中各细胞类型表达的配体与受体，并衍生出CellPhoneDB、CellChat、NicheNet、SingleCellSignalR等细胞-细胞通讯推理方法，但存在两个关键局限：未整合细胞空间邻近信息，且推断的是细胞群体而非单细胞的信号。空间转录组技术可同时测量基因表达与空间坐标，为整合空间邻近性提供可能，现有空间转录组通讯方法多在预设细胞类型（群体）层面识别互作，少数细胞水平方法或未对每个LR对单独预测，或将接触依赖与可扩散互作用同一模型处理，且多仅推断测量时刻的静态状态，难以刻画随时间的变化。为填补上述空白，研究人员开发CytoSignal及VeloCytoSignal，以细胞分辨率从空间转录组数据中推断静态与动态LR信号，并区分接触依赖与可扩散机制，进一步通过原位实验验证。

主要关键技术方法

研究人员采用Slide-seq v2、Slide-tags、Stereo-seq及Visium HD等空间转录组数据集，涵盖小鼠胚胎全组织及脑发育、帕金森病模型小鼠脑衰老等多样本队列。核心技术包括：1）CytoSignal算法：定义空间邻域，对可扩散互作用高斯核加权ε-球邻域平滑配体信号，对接触依赖互作用Delaunay三角剖分邻域均匀加权，计算各位点LRscore＝配体接收量×受体表达，并进行空间置换检验与FDR校正；2）VeloCytoSignal：基于VeloVAE推断的RNA速度（spliced/unspliced），用乘积法则求LRscore的时间导数dS/dt作为信号速度（LRvelo）；3）多样本差异信号：用负二项回归（Nebula）以LRscore为响应变量，纳入年龄、基因型、细胞类型等协变量；4）信号相关基因识别：弹性网络回归或Wilcoxon检验筛选预测LRscore的基因，并进行GO富集；5）实验验证：空间邻接切片分别做Visium HD与PLA，图像配准后将PLA荧光二值化作为金标准，以AUC评估各计算方法。

研究结果

CytoSignal and VeloCytoSignal identify locations and dynamics of signaling interactions at cellular resolution

CytoSignal核心思想是LR信号由特定组织位点的蛋白质互作驱动，为每个位点计算LRscore＝L×R（空间邻域内配体加权求和×受体表达），通过空间置换构建零分布并FDR校正，可识别显著互作位点、信号空间梯度及信号相关基因；可扩展至多样本差异信号。VeloCytoSignal将配体与受体的RNA速度代入LRscore对时间的导数，得到各邻域信号变化率（LRvelo），箭头方向表信号增强（红/上）或减弱（蓝/下），长度表变化速率。

CytoSignal detects spatially resolved signaling interactions, spatial gradients and signaling-associated genes in Slide-seq and Slide-tag data

研究人员将CytoSignal应用于小鼠胚胎脑的Slide-seq v2与Slide-tags数据。输出各位点LRscore空间分布，并以3D图展示信号发送与接收细胞。Top互作包括可扩散的Sema3a–Plxna4/Nrp1（轴突导向）、Wnt5a–Epha7（WNT通路），以及接触依赖的Efnb1–Epha4（轴突导向/再生）。以皮质深度为横轴绘制Sema3a–Plxna4复合体LRscore，显示先升后降、在SVZ达峰的梯度；Efnb1–Epha4的LRscore随距脑组织 centroid距离增大而升高。用弹性网络筛选与LRscore相关的差异表达基因：Wnt5a–Epha7相关基因富集于“Wnt信号调控”“经典Wnt通路”；Efnb1–Epha4相关基因富集于“神经元分化正向调控”“神经管发育”。汇总各位点显著互作数发现：成纤维细胞邻近区富集可扩散互作，放射状胶质细胞及其周围神经元富集接触依赖互作，与已知生物学一致。

CytoSignal reveals locations and signaling-associated genes for contact-dependent and diffusible signaling interactions in mouse embryo Stereo-seq data

应用于E9.5–E16.5小鼠全胚胎Stereo-seq数据，CytoSignal检出Dll1–Notch1（接触依赖）在脉络丛与脑区交界富集，相关基因GO富集于“中枢神经系统发育”“神经元命运承诺”；Fgf8–Fgfr1（可扩散）在脉络丛-脑膜边界活跃，相关基因富集于神经发育相关条目。分别汇总各簇间显著边发现：软骨原基、颌牙区是主要可扩散信号收发区（依赖SHH、BMP、FGF、WNT等）。时序上，脉络丛接触依赖互作E14.5最强，而可扩散互作峰值区不同，体现发育结构与阶段主导模式差异；Fgf8–Fgfr1的发送细胞可来自邻簇较远位置，而Dll1–Notch1边缘近乎直线（直接相邻）。

Spatially adjacent PLA and high-resolution spatial transcriptomic profiling confirm locations of LR protein–protein interactions predicted by CytoSignal

为弥补计算缺乏金标准的问题，研究人员用PLA：两一抗结合配体/受体，PLA探针仅在两者<40 nm时扩增荧光点。对同胚胎连续切片分别做Visium HD与PLA（Igf2–Igf2r、Spp1–Cd44、Fgf8–Fgfr1、Efna3–Epha5、Dll1–Notch1），图像配准后以二值PLA为真值。全胚胎水平相关性不高，但按无监督聚类划分区域后训练分类器，CytoSignal预测PLA信号的AUC在几乎所有区域稳健且常优于SpatialDM、COMMOT、LIANA+、NICHES等细胞分辨率对标方法，也优于集群水平方法，提升源于空间平滑策略；CytoSignal在时间与内存效率上也更优。

CytoSignal identifies differential signaling interactions from multisample spatial transcriptomic data

用负二项回归拓展多样本差异分析，可纳入细胞类型、空间区域、病例-对照、年龄等协变量。以scDesign3模拟Stereo-seq多条件数据，改变配体/受体表达的细胞数与幅度，CytoSignal保持低假阳性与假阴性；用真实Stereo-seq生物学重复估假阳性率中位数=0。应用于帕金森病模型年轻（4只）与老年（5只）小鼠空间转录组，鉴定出42个可扩散与3个接触依赖互作显著变化（FDR<5%），老年鼠免疫相关互作（如Spp1–Cd44、Sema6d/Plexin复合体）信号增强，与微胶质细胞增多一致；同时识别出细胞类型关联互作。

VeloCytoSignal identifies spatiotemporal dynamics of signaling activity during mouse embryonic development

将VeloCytoSignal用于E10.5–E13.5 Stereo-seq，以各时间点盲测下一时间点趋势。肝脏特异性Alb–FcRn与Lgals9–Cd47互作的速度图显示肝脏内信号显著上升，配体Alb与受体B2m/Fcgrt速度一致；以真实数据跨时间点平均LRscore验证趋势吻合。颌牙区Wnt5a–Antxr1互作在E11.5–E12.5显著上升，配体/受体速度支持该趋势，契合牙齿发育中Wnt信号瞬时脉冲。

讨论与结论

研究人员指出，LR介导的细胞-细胞通讯在分化、稳态、免疫与疾病中至关重要但难以前瞻性无偏倚研究。CytoSignal仅需细胞×基因矩阵与细胞×空间坐标，以空间邻域加权计算各位点LRscore，通过置换检验识别显著互作，可进一步做空间梯度、信号相关基因、接触/可扩散分区及多样本差异分析；VeloCytoSignal额外需要spliced/unspliced计数，用RNA速度推演信号变化率。研究在小鼠胚胎发育、成体神经发生及神经退行模型中被应用，且PLA原位验证显示预测得分对应蛋白互作位点。

论文认为CytoSignal适用于多数空间转录组技术，未来可拓展至肿瘤微环境（恶性-正常-免疫细胞互作）及损伤组织修复时序数据等生理病理情境。该方法为快速增长的空转数据提供了稳健可扩展的分析框架，随着原位多模态测量发展，其适用性有望进一步延伸。

研究结论可译为：CytoSignal从空间转录组数据中以细胞分辨率推断信号互活的位点与动态；通过细胞水平策略可实现信号空间梯度、信号相关基因、接触与可扩散互作定位及多样本差异互作等新型分析；模型在小鼠胚胎发育、成体脑神经发生及神经退行模型中识别互作，且预测得分与原位LR蛋白互作位点对应。