从细胞到细胞核，LUNA-FX7™把控单细胞测序质控要点

背景介绍

单细胞测序技术，指在单个细胞水平上，对基因组、转录组及表观基因组水平进行测序分析的技术。传统的测序，是在多细胞基础上进行的，实际上得到的是一堆细胞中信号的均值，丢失了细胞异质性（细胞之间的差异）的信息。而单细胞测序技术能够检出混杂样品测序所无法得到的异质性信息，从而很好的解决了这一问题。

单细胞测序需要投入大量时间和金钱成本，确保细胞样品的质量和数量至关重要，因此要求使用的细胞计数仪必须准确可靠计数所有样本类型的细胞，包括游离组织、分离的细胞核、全血或培养细胞株。

在这里，我们展示了如何使用LUNA-FX7™细胞计数仪进行多种细胞样品的准确计数及质量控制。

首先，解离组织，分离出单个细胞。不同类型组织的细胞外基质(ECM)不同，需要对酶和化学分离方法组合进行优化，以确保获得单个的细胞。

细胞样本质量评估 

收集到的细胞样本先用AO/PI染料(Cat# F23001)进行染色，然后使用默认的Protocol进行细胞计数和活性分析。第一个样本，从人外周血中分离出来B 细胞，具有较高的活力和单细胞分离度(图1) 可用于下游建库准备。第二个样本，AsPC-1细胞发生不完全分离。图像清楚地显示了相当一部分的细胞是结合在一起的，比例高达9%，AsPC-1细胞活力只有56%，因此从细胞活力和单细胞比例结果判断，该样品不适合进行下游的单细胞实验(图2)。

由此可见，一个基于图像的准确的计数仪对于评估单细胞实验样品数量和质量是至关重要的。

图1：B细胞样本

图2：AsPC-1样本

分离的细胞核质量评估

对于一些单细胞测序应用，分离的细胞需要进一步处理以生成分离的和完整的细胞核。接下来，我们看一下LUNA-FX7™在评估分离细胞核的质量和数量方面的应用。我们检测了3种细胞系——HL60、HeLa和HEK。图3展示了HL60细胞的3种细胞核分离结果，左图：完整的细胞，中图：细胞核部分分离，右图：细胞核完全分离。（细胞膜完整的活细胞呈现绿色荧光，死亡细胞和离体细胞核呈现红色荧光）。LUNA-FX7™可以通过细胞大小(图3，图5)区分死细胞和细胞核。例如，HL-60活细胞平均直径为13.4μm，HL-60细胞核平均直径为8.3μm，说明成功去除细胞膜和浆体部分。测量未完全分离核的样品的平均直径为10.2 μm，表明该样品中核未完全分离不能进行下游处理(图3）。

此外，LUNA-FX7™的高分辨率明场图像可用于直观的判断分离核的质量。分离的细胞核可以很容易地与完整的细胞区分开来，因为细胞核的边界没有细胞膜更薄、更不明显、颜色更浅。(图4和图5)。 

图3：HL60细胞核分离结果。在BF图像中，完整的细胞比细胞核颜色更深。

图4：活细胞、死细胞和细胞核的区分。

图5：细胞核评估。明场和叠加的荧光图像可区分不同的细胞状态。LUNA-FX7™可以准确区分具有大细胞质和小核(HeLa)的样品和相对于细胞质具有大核的细胞类型 (HEK293)。

综上所述，LUNA-FX7™细胞计数仪通过三个通道的成像(明场、绿色荧光场、红色荧光场)结合精细的Tag算法，可为您单细胞实验前的多种细胞样品提供准确的样品计数和质量控制以确保下游实验的成功。

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LUNA FL是一款兼具明场和荧光场成像的细胞计数仪，可用于细胞系、原代细胞、干细胞、PBMC、酵母等细胞计数和活性检测，还可用于转染GFP细胞的转染效率检测。

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