牙龈毛细胞噬菌（Capnocytophaga gingivalis）在口腔鳞状细胞癌中的检出、定量及其与癌变相关基因表达的关联研究

《Microorganisms》：Genomic Insights and Antimicrobial Resistance Profiling of Diarrheagenic Escherichia coli in Bhutan: A Retrospective Whole-Genome Sequencing Study

摘要：背景：口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）近年来日益被认为与口腔微生物群及慢性牙周炎症相关。尽管主要牙周致病菌已被广泛研究，但牙龈毛细胞噬菌（Capnocytophaga gingivalis，C. gingivalis）在口腔癌发生中的作用仍不明确。本研究调查了C. gingivalis在良性口腔病变、口腔潜在恶性疾病（oral potentially malignant disorders，OPMDs）和OSCC中的流行情况并进行定量分析，同时评估其与癌变相关基因表达之间的关联。方法：纳入90例牙周炎患者：30例良性病变、30例OPMDs、30例OSCC。采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）对C. gingivalis进行定量；采用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）分析VEGF、Cyclin D1、PIK3CA、DUSP16、mTOR和MAPK14的相对表达。结果：在2例良性病变、11例OPMDs和18例OSCC样本中检出C. gingivalis（p < 0.001）。与良性病变组相比，OPMDs组和OSCC组的总体细菌负荷显著更高（p = 0.001）。OPMDs组和OSCC组中PIK3CA与MAPK14的表达显著升高。在OSCC样本中，C. gingivalis丰度与VEGF及Cyclin D1表达呈正相关。结论：C. gingivalis在所检测病变中的流行率与丰度呈进行性升高，并与参与癌变过程的基因表达改变相关，这支持其在OSCC进展中可能具有潜在作用。

该论文发表于《Microorganisms》，研究聚焦于口腔微生物与口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）发生发展的关系，尤其关注既往在口腔癌研究中相对被忽视的牙龈毛细胞噬菌（Capnocytophaga gingivalis，C. gingivalis）。长期以来，吸烟和饮酒被视为OSCC最明确的危险因素，但临床中仍可见无吸烟、无饮酒史患者发生OSCC，提示传统病因学框架并不足以解释全部发病机制。随着研究推进，口腔卫生不良、慢性炎症、牙周疾病及口腔微生物群失衡逐渐被认为是OSCC发生的重要背景因素。既往关于口腔微生物与OSCC关系的研究多集中于牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、齿垢密螺旋体等经典牙周致病菌，而C. gingivalis虽被认为参与牙菌斑生物膜形成并存在于牙周炎相关环境中，但其是否与口腔癌前病变乃至癌变进展相关，证据仍较缺乏。因此，研究人员围绕这一知识空白，考察C. gingivalis在不同类型口腔病变中的检出与负荷变化，并分析其与癌变相关基因表达之间的关系，以期为理解OSCC相关微生物学机制提供更直接证据。

目前相关研究存在几个突出问题。首先，C. gingivalis在OSCC中的研究明显少于其他牙周相关菌，且既往证据主要停留在唾液标志物提示或组织存在性观察层面。其次，即便已有研究提示口腔微生物可能通过慢性炎症、抗凋亡活性及促血管生成等机制影响癌变，但尚无研究直接评估C. gingivalis负荷与宿主癌变相关信号分子表达之间的对应关系。再次，牙周炎本身属于多菌种相互作用驱动的慢性炎症性疾病，在这种复杂微生态背景下，单一菌种的作用机制更难界定。基于此，开展针对C. gingivalis的聚焦研究具有必要性，有助于先明确该菌与宿主分子事件之间是否存在关联，再进一步讨论更复杂的多菌互作效应。

研究人员设计了一项横断面研究，纳入2022年1月至2024年12月期间在贝尔格莱德大学牙学院口腔医学与牙周病学科及颌面外科就诊的患者。全部受试者均患有牙周炎，并依据组织病理学结果分为良性病变组、口腔潜在恶性疾病（oral potentially malignant disorders，OPMDs）组和OSCC组，各30例。研究结论显示，C. gingivalis从良性病变到OPMDs再到OSCC呈现检出率和总体负荷逐步升高趋势；与此同时，PIK3CA和MAPK14在OPMDs和OSCC中较良性病变显著上调；在OSCC中，C. gingivalis丰度与VEGF表达呈正相关，在纳入全部OSCC样本分析时还与Cyclin D1表达呈正相关。这些结果提示，C. gingivalis可能与口腔癌变相关分子通路改变有关，并可能参与OSCC进展相关的微环境变化。该研究的重要意义在于，它将一种既往关注不足的口腔共栖/条件致病菌纳入口腔癌研究视野，并在组织层面建立了其与癌变相关基因表达之间的统计学关联。

主要技术方法方面，研究人员在单中心连续纳入90例伴牙周炎的口腔黏膜可疑病变患者，并经组织病理学确认为30例良性病变、30例OPMDs和30例OSCC。研究基于福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed, paraffin-embedded，FFPE）组织切片，采用酚-氯仿法提取DNA，通过实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测并定量C. gingivalis，以GAPDH为内参并采用2^?ΔCt法进行相对定量；同时提取RNA并采用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析VEGF、Cyclin D1、PIK3CA、DUSP16、mTOR、MAPK14的相对表达。统计学上采用χ²检验、Fisher确切检验、Kruskal–Wallis H检验、Mann–Whitney U检验及Spearman秩相关分析。

在研究结果部分，论文首先报告了“3.1. Demographic and Clinical Characteristics of the Study Population”。该部分显示，三组在病变构成上各不相同：良性病变包括乳头状瘤、纤维瘤和摩擦性角化；OPMDs包括白斑、红斑和舌下角化；OSCC中含少量疣状亚型。人口学及临床特征比较发现，性别、牙周分期、生物膜存在情况及探诊出血（bleeding on probing，BOP）在组间存在统计学差异。菌斑指数（plaque index，PI）和BOP在OSCC与良性病变之间差异最为显著，OSCC与OPMDs之间的BOP也存在差异。这部分结果说明，尽管所有受试者均患牙周炎，但不同病变组在口腔卫生和炎症严重程度方面并不完全一致，尤其OSCC组表现出更差的牙周相关指标。

“3.2. Bacterial Detection and Quantification Across Lesion Groups”部分是本文核心结果之一。研究人员发现，C. gingivalis在良性病变中仅检出2例，在OPMDs中检出11例，在OSCC中检出18例，整体组间差异显著。若仅分析阳性样本中的细菌定量，各组差异并不显著；但若将全部样本纳入，不论是否阳性，则总体细菌负荷在三组间存在显著差异，且良性病变与OPMDs、良性病变与OSCC之间均有显著差异，而OPMDs与OSCC之间未达显著性。该结果表明，C. gingivalis与病变恶性潜能增强之间更相关的并非单纯“阳性样本中的菌量差别”，而是随病变进展所表现出的更高检出概率和整体负荷增加。这种模式支持C. gingivalis在口腔病变进展中可能具有累积性存在优势。

“3.3. Gene Expression Analysis Across Lesion Groups”部分显示，在所检测的多个癌变相关基因中，仅PIK3CA和MAPK14在三组间呈现显著差异。进一步两两比较表明，PIK3CA在良性病变与OSCC、良性病变与OPMDs之间均存在显著差异，而OSCC与OPMDs之间无显著差异；MAPK14也呈相同趋势。该发现说明，从良性病变向潜在恶性病变转变时，PI3K相关信号与p38 MAPK相关应激/炎症信号已出现上调，并在恶性阶段持续维持较高水平。也就是说，部分关键分子事件并非只在浸润癌阶段才出现，而可能在癌前病变阶段已经建立，反映出口腔癌发生发展中的分子连续性。

“3.4. Correlation Analysis”部分进一步评估了细菌丰度与宿主基因表达的关系。研究人员在所有C. gingivalis阳性样本中进行Spearman相关分析时，未观察到显著相关。随后，在C. gingivalis阳性的OSCC样本内部分析，发现该菌丰度仅与VEGF表达呈显著正相关。进一步在所有OSCC样本中、不区分C. gingivalis阳性与否进行分析，则发现Cyclin D1和VEGF的相对表达均与C. gingivalis定量呈正相关，而在良性病变组和OPMDs组中未见类似相关性。该结果提示，在恶性病变环境中，C. gingivalis与血管生成和细胞周期调控相关分子可能存在更紧密联系，其中VEGF关联最为稳定。由于VEGF是肿瘤血管生成的重要介质，Cyclin D1则参与G₁向S期转变，这种相关模式使C. gingivalis与OSCC微环境中的促增殖、促血管生成特征建立起统计学联系。

讨论部分围绕上述发现进行了收束。研究人员指出，口腔卫生不良、慢性炎症和微生物失衡与头颈部肿瘤发生的关系已有较多流行病学支持，本研究结果与既往关于OSCC患者男性比例较高、口腔卫生指标较差的观察一致。由于全部受试者均伴牙周炎，这一设计有助于减少牙周状态差异带来的混杂，但也限制了牙周炎与OSCC各自独立效应的区分。对于C. gingivalis，研究人员强调，本研究首次使用qPCR在不同口腔病变组织中比较其定量水平，并观察到其从良性病变到OPMDs、再到OSCC的总体负荷递增，这一现象支持肿瘤相关微环境可能更利于该菌定植或持续存在。对于分子表达结果，研究人员认为PIK3CA和MAPK14的升高提示增殖、生存、炎症和应激反应相关通路在口腔癌前及癌变过程中均已被卷入。至于C. gingivalis与VEGF、Cyclin D1的相关性，论文保持谨慎态度，明确指出观察性研究不能证明因果关系，这种关联也可能反映更广泛的炎症性、多菌种肿瘤微环境，而非C. gingivalis单独直接驱动相应基因上调。论文同时指出样本量有限、单中心设计、未进行全面微生物组分析、缺乏功能和机制实验等局限。

研究结论部分可译述为：本研究揭示，C. gingivalis在良性病变、口腔潜在恶性疾病及口腔鳞状细胞癌中，其检出率和总体负荷呈进行性升高。此外，细菌负荷与VEGF基因表达之间的关联，以及PIK3CA和MAPK14表达的增加，尤其是在OSCC组中的表现，共同强调了C. gingivalis在口腔鳞状细胞癌进展中的潜在生物学意义。

总体而言，该研究以较为聚焦的还原性策略，展示了C. gingivalis在不同口腔病变阶段中的分布梯度，并将其与若干关键癌变相关分子联系起来。其主要贡献不在于证明病因因果，而在于为后续机制研究提供了清晰的组织学和分子关联依据，提示在OSCC研究中，除经典牙周致病菌外，C. gingivalis同样值得被纳入重点考察范围。