《Journal of Fungi》：In Vitro Anti-Aspergillus Activity and Antifungal Interactions of Monoclonal Antibodies 1D2 and 4E4
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目的：确定单克隆抗体（mAb）1D2和4E4单独以及与伏立康唑（voriconazole）、泊沙康唑（posaconazole）、两性霉素B（amphotericin B）和卡泊芬净（caspofungin）联合使用的体外抗曲霉（Aspergillus）活性，
目的：确定单克隆抗体（mAb）1D2和4E4单独以及与伏立康唑（voriconazole）、泊沙康唑（posaconazole）、两性霉素B（amphotericin B）和卡泊芬净（caspofungin）联合使用的体外抗曲霉（Aspergillus）活性，并评估所选抗微生物制剂是否会干扰1D2/4E4与曲霉抗原的结合。方法：在基于微孔板的测定中测定1D2、4E4和所有抗真菌药物的体外抗真菌活性。使用棋盘法（checkerboard assay）测定1D2和4E4单独以及与伏立康唑、泊沙康唑、两性霉素B和卡泊芬净联合使用的体外抗曲霉活性。最后，使用竞争酶联免疫吸附试验（competitive ELISA）评估所选抗真菌和抗菌药物是否干扰1D2和4E4与固定的曲霉抗原的结合。结果：1D2与伏立康唑、泊沙康唑、两性霉素B和卡泊芬净对四种不同曲霉属（Aspergillus）物种的体外相互作用均为相加（additive），分级抑菌浓度指数（Fractional Inhibitory Concentration Index, FICI）介于0.5和1之间。同样，4E4与上述四种抗真菌药物对烟曲霉（A. fumigatus）的体外相互作用均为相加。对于4E4和卡泊芬净对所有四种测试的曲霉属物种也检测到相加相互作用。然而，对于4E4联合伏立康唑、泊沙康唑和两性霉素B对抗黄曲霉（A. flavus）、黑曲霉（A. niger）和土曲霉（A. terreus），未发现相互作用，FICI介于1和4之间。此外，在竞争酶联免疫吸附试验（competitive ELISA）中，没有任何测试的抗真菌或抗菌药物显著干扰1D2/4E4与曲霉抗原的结合。结论：在本研究中，1D2和4E4对测试的曲霉分离株显示出体外生长抑制活性。具体而言，1D2在所有测试物种中与测试的抗真菌药物均显示相加相互作用，而4E4显示出更具物种和药物依赖性的相互作用特征。在检查的竞争酶联免疫吸附试验（competitive ELISA）条件下，测试的抗微生物制剂未 measurable 地干扰1D2/4E4的结合。总体而言，这些发现为支持进一步评估1D2和4E4提供了初步的体外证据。
该研究发表于《Journal of Fungi》。目前，由于免疫抑制方案和抗癌治疗的日益频繁使用，免疫功能低下人群中曲霉（Aspergillus）感染的发病率有所增加。当前指南推荐伏立康唑（voriconazole）和艾沙康唑（isavuconazole）作为侵袭性曲霉病（Invasive Aspergillosis, IA）的一线疗法，而泊沙康唑（posaconazole）、两性霉素B（amphotericin B）制剂和棘白菌素类（echinocandins）用于特定的预防、替代、挽救或联合治疗环境。然而，现有药物的高毒性、抗真菌耐药性和有限的活动谱备受关注，特别是长期临床唑类暴露及农业唑类杀菌剂相关的环境选择导致唑类耐药烟曲霉（A. fumigatus）报道日益增多。因此，迫切需要寻求具有更高特异性、更低毒性和更广泛临床相关曲霉物种活性的新型抗曲霉策略。研究人员此前已制备出针对曲霉细胞壁糖蛋白抗原的单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）1D2和4E4，并评估其作为检测早期侵袭性曲霉病期间曲霉抗原的潜在诊断抗体。基于此，研究人员假设1D2和4E4可能具有治疗侵袭性曲霉病（IA）的潜力，故开展本研究以确定1D2和4E4单独及与常用抗真菌药物联用的抗曲霉活性，并评估所选抗菌和抗真菌制剂是否干扰其与曲霉抗原的结合。研究得出1D2和4E4对测试菌株有体外生长抑制活性且大部分联用显示为相加（additive）相互作用，测试的抗微生物制剂未显著干扰抗体结合的结论，这为后续评估提供了初步体外证据，具有重要意义。
研究人员为开展研究用到的主要关键技术方法包括：使用源自美国典型培养物保藏中心（ATCC）的烟曲霉（AF293）、黄曲霉（NRRL 3357）及新西兰坎特伯雷健康实验室提供的临床分离株（包括烟曲霉、黑曲霉、土曲霉）。采用基于肉汤微量稀释的测定法评估单体及药物的体外生长抑制活性，定义最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最低有效浓度（Minimum Effective Concentration, MEC）端点。采用基于EUCAST肉汤微量稀释法改良的棋盘技术（checkerboard technique）进行单抗与抗真菌药的体外联合滴定测试，计算分级抑菌浓度（Fractional Inhibitory Concentration, FIC）及分级抑菌浓度指数（FICI）以评估相互作用。采用竞争酶联免疫吸附试验（competitive ELISA）评估抗微生物制剂对单抗与固定化烟曲霉细胞壁片段（Cell Wall Fragments, CWFs）结合的干扰。
3.1. In Vitro Growth-Inhibitory Activity of mAb 1D2/4E4 and Individual Agents
研究人员通过体外生长抑制测定得出，测试的烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉分离株均受到mAb 1D2、4E4以及伏立康唑、泊沙康唑、两性霉素B和卡泊芬净的生长抑制。1D2或4E4在12.5 μg/mL的MIC样生长抑制终点未见可见菌丝生长，同型对照抗体6B10在匹配浓度下未产生可比拟的生长抑制，表明观察到的抑制效应非非特异性IgM相关效应所致。
3.2. Antifungal Activity of 1D2 and 4E4 in Combination with Antifungal Agents Against Different Aspergillus Species
通过棋盘法测定得出，1D2与所有抗真菌药物对所有测试曲霉物种的体外相互作用均为相加（FICI介于0.5和1.0之间）。4E4与四种抗真菌药物对烟曲霉的相互作用均为相加；4E4与卡泊芬净对所有四种曲霉物种亦为相加相互作用；但4E4联合伏立康唑、泊沙康唑和两性霉素B对抗黄曲霉、黑曲霉和土曲霉未发现相互作用（FICI介于1和4之间）。
3.3. Assessment of Antibacterial Drug Interference with 1D2/4E4 Binding
通过竞争ELISA测定得出，哌拉西林（piperacillin）、美罗培南（meropenem）、头孢他啶（ceftazidime）、环丙沙星（ciprofloxacin）、万古霉素（vancomycin）和庆大霉素（gentamicin）均未显著减少1D2与固定化烟曲霉抗原的结合信号，也未影响4E4的结合，表明测试抗菌药物在所用条件下不干扰1D2/4E4抗原结合。
3.4. Assessment of Antifungal Drug Interference with 1D2/4E4 Binding
通过竞争ELISA测定得出，伏立康唑、泊沙康唑、两性霉素B和卡泊芬净均未显著减少1D2与固定化烟曲霉抗原的结合信号，也未影响4E4的结合，表明测试抗真菌药物在检查条件下未干扰1D2/4E4与固定化烟曲霉抗原的结合。
讨论部分总结指出，本研究显示临床相关曲霉分离株受mAb 1D2和4E4及常规抗真菌药物抑制。1D2与测试抗真菌药物在所有分离株中呈相加相互作用；4E4对烟曲霉与四种药物及对所有物种与卡泊芬净呈相加相互作用，但对黄曲霉、黑曲霉和土曲霉与唑类及两性霉素B无相互作用。抗微生物制剂未显著干扰抗体结合。研究人员选择代表性药物评估了与作用于不同机制（麦角固醇生物合成抑制、膜完整性破坏、细胞壁合成干扰）的抗体相互作用。1D2的广谱相加及4E4的物种依赖性可能源于抗体结合对真菌表面可及性、细胞壁结构或早期菌丝发育的改变，或反映表位丰度、糖蛋白组成及细胞壁抗原可及性的种间差异，但具体靶点未完全定义。任何测试的组合中均未观察到拮抗（antagonism）作用，表明抗体与现有抗真菌类别在体外兼容。观察到的相加效应支持其作为潜在的辅助抗曲霉候选而非替代现有疗法。研究局限性包括仅体外实验、未评估动物模型疗效及宿主机制、测试分离株数量有限且未含唑耐药株、相加相互作用机制未定义、FICI不能完全预测体内疗效、未特定评估卡泊芬净矛盾效应（paradoxical effect）及竞争ELISA未含临床基质需进一步验证。
结论部分翻译：总之，1D2和4E4对测试的临床相关曲霉分离株显示出体外生长抑制活性。此外，mAb 1D2在体外对所有测试的曲霉物种与伏立康唑、泊沙康唑、两性霉素B和卡泊芬净显示相加相互作用。对mAb 4E4也检测到类似的相加活性，尽管对于4E4联合伏立康唑、泊沙康唑或两性霉素B对抗黄曲霉、黑曲霉和土曲霉未发现相互作用。此外，在竞争酶联免疫吸附试验（competitive ELISA）中，测试的抗真菌和抗菌药物未显著干扰1D2或4E4与曲霉抗原的结合。总体而言，这些发现应被解释为支持对1D2和4E4进行进一步机制、诊断和体内评估的初步体外证据。它们未确立治疗功效或临床诊断性能。
