辣椒黄环斑正番茄斑萎病毒属病毒N结构蛋白多克隆抗体的制备与应用

《Infection, Genetics and Evolution》：Preparation and application of a polyclonal antibody against the N structural protein of chilli yellow ringspot orthotospovirus

CYRSV是一种在云南新发现的病毒，引起蔬菜作物病害。研究人员将N基因克隆到pTOPO-D1载体中，以制备重组蛋白和抗体。研究人员开发了多种利用抗体的方法，包括ELISA和DIBA。研究人员的检测方法能够检测大量感染CYRSV的田间样本。

**论文解读：辣椒黄环斑正番茄斑萎病毒属病毒（CYRSV）N结构蛋白多克隆抗体的制备与应用**

**研究背景与问题**

辣椒黄环斑正番茄斑萎病毒属病毒（Chilli yellow ringspot orthotospovirus, CYRSV）是2020年在中国云南省首次报道的一种新病毒，属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus）。该病毒侵染辣椒和番茄等蔬菜作物，导致植株矮化、叶片黄环斑、果实同心斑及黄环斑等症状。云南省已发现三种正番茄斑萎病毒属病毒，包括番茄环斑病毒（TZSV）、朱顶红褪绿环斑病毒（HCRV）和CYRSV，对多种作物造成严重损失。番茄作为全球重要蔬菜和营养作物，在云南种植面积扩大，病毒病（尤其是正番茄斑萎病毒属病毒引起的病害）严重影响其品质、产量和经济效益。然而，CYRSV与其他同属病毒引起的症状相似，仅凭症状难以区分，且目前尚无针对CYRSV N蛋白的商业化抗体。为此，研究人员开展本研究，旨在制备高质量的抗CYRSV N结构蛋白多克隆抗体，并建立基于抗体的免疫学检测方法，为CYRSV的检测、诊断及科学防控提供技术支持。本研究发表于《Infection, Genetics and Evolution》。

**研究人员开展的研究、结论与意义**

研究人员将CYRSV的N基因（GenBank: PV197272.1）克隆至原核表达载体pTOPO-D1，在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中诱导表达重组His标签融合蛋白，经Ni亲和层析纯化后免疫新西兰白兔，制备多克隆抗体。随后开发了间接ELISA（ID-ELISA）、斑点免疫结合试验（DIBA）和Western blot三种检测方法，并应用于田间样本检测。结果表明，成功制备了高效价（>1:256000）的抗体，建立的DIBA方法可有效检测感染CYRSV的番茄和辣椒果实样本，与RT-PCR和透射电镜（TEM）观察结果一致。这是中国首次报道CYRSV免疫学检测方法的建立，为大规模田间样本的快速检测及N蛋白功能研究提供了重要工具。

**关键技术方法**

研究人员采用以下主要技术方法：（1）基因克隆与原核表达：将CYRSV N基因通过定向拓扑异构酶克隆技术插入pTOPO-D1载体，转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达重组N蛋白。（2）蛋白纯化：利用His标签蛋白纯化试剂盒（基于Ni亲和层析）纯化重组蛋白，以200 mM咪唑洗脱获得高纯度蛋白。（3）多克隆抗体制备：纯化的重组N蛋白与弗氏佐剂乳化后，对11周龄新西兰白兔进行皮下多点免疫，经四次免疫后收集血清，通过Protein A亲和层析纯化总IgG，获得浓度3.479 mg/mL的抗体。（4）免疫检测方法建立：包括间接ELISA（以重组N蛋白包被，抗体稀释梯度检测）、DIBA（以NC膜为载体，BCIP/NBT显色）和Western blot（以pCass-mCherry-N瞬时转化本氏烟叶片后检测）。（5）样本来源：田间感染的番茄和辣椒果实样本采集自云南省元谋县。

**研究结果**

**3.1 CYRSV N基因表达载体的构建**
研究人员通过定向拓扑异构酶克隆技术将CYRSV N基因（828 bp）插入原核表达载体pTOPO-D1，经PCR和测序验证，成功构建了重组质粒pTOPO-D1-N，N基因与His标签框内融合。

**3.2 CYRSV N融合蛋白的表达与纯化**
将pTOPO-D1-N转化BL21（DE3）后，经0.5 mM IPTG在18°C诱导18小时，SDS-PAGE分析显示重组N蛋白（约37 kDa）主要以不溶性形式存在于沉淀中。使用Ni亲和层析柱，以200 mM咪唑洗脱获得高纯度重组蛋白，浓度1.47 mg/mL，总量4.41 mg。

**3.3 抗CYRSV N抗体效价的测定**
通过间接ELISA测定纯化抗体（3.48 mg/mL）的效价：以1 μg/mL重组N蛋白包被，抗体稀释度1:500至1:512000，P/N>2.1判定阳性。结果表明抗体效价高于1:256000，最佳抗体稀释范围为1:8000至1:256000。抗原浓度梯度实验显示抗体与N蛋白具有良好的结合效果。

**3.4 CYRSV-N特异性抗体的验证**
Western blot检测显示，pCass-mCherry-N瞬时转化本氏烟叶片后，制备的抗体能特异性识别N蛋白（条带清晰）。DIBA分析显示，重组N蛋白和CYRSV阳性番茄果实提取液在NC膜上均产生蓝紫色斑点，灵敏度检测表明N蛋白稀释至1:256倍（5.74 μg/mL）时仍可检出，而病毒提取液在稀释1:320倍时颜色极浅。

**3.5 抗CYRSV-N抗体在DIBA中检测田间样本**
采集的田间番茄和辣椒果实样本（表现黄环斑、皱缩等症状）同时进行RT-PCR、TEM和DIBA检测。RT-PCR扩增出N基因片段，TEM观察到病毒粒子，DIBA均显示阳性蓝紫色斑点。三种方法结果一致，10份样本均为CYRSV阳性，证明DIBA方法可靠且适用于田间样本的大规模检测。

**讨论与结论**

讨论部分强调了番茄作为全球重要蔬菜作物的地位，以及云南元谋县番茄病毒病（尤其是CYRSV）的严峻形势。由于病毒病缺乏有效防治药剂，及时诊断成为控制传播的关键。本研究利用大肠杆菌原核表达系统（具有遗传背景清晰、产量高、成本低等优点）成功表达并纯化了His标签N蛋白，制备了多克隆抗体，并建立了ID-ELISA、DIBA和Western blot三种免疫学检测方法。这是中国首次报道CYRSV的免疫学检测方法，对于检疫和贸易中大量种植材料的快速检测具有重要意义。为避免DIBA中酚类物质氧化干扰，研究人员选用BCIP/NBT作为显色底物，形成不溶性深蓝色至蓝紫色结晶，便于观察。抗体稀释比1:8000至1:256000时ID-ELISA效果最佳，DIBA中N蛋白稀释256倍（5.74 μg/mL）可有效检测。抗体检测可补充核酸检测的不足，结合TEM可提高诊断准确性，但TEM成本较高。研究中10份田间样本经三种方法检测均为阳性，但由于所有结果均属同一类别，无法计算Cohen's或Fleiss' Kappa值，这是本研究的局限性。

**研究结论**（原文翻译）：这是首次报道制备针对重组CYRSV结构蛋白N的多克隆抗体。所得抗N多克隆抗体可用于高效检测CYRSV感染以及N蛋白功能研究。