综述：ASK1在癌细胞死亡中的作用：来自体外与体内研究的见解

《Cells》：ASK1 in Cancer Cell Death: Insights from In Vitro and In Vivo Studies

凋亡信号调节激酶1（ASK1）是一种参与应激诱导细胞凋亡的丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAP3K）。越来越多的证据表明，ASK1的激活与多种化合物的抗癌活性有关，尤其是那些诱导氧化应激或内质网应激（ER stress）的化合物。本综述总结了在肺癌、乳腺癌及妇科癌症或胃肠道癌症模型中，使用天然产物、植物化学物质和合成药物治疗后表现出ASK1依赖性细胞凋亡的研究，重点关注将ASK1与下游JNK和p38 MAPK通路激活、线粒体功能障碍以及半胱天冬酶依赖性细胞死亡联系起来的机制证据。研究的选择基于对ASK1激活及其在观察到的抗癌作用中参与情况的直接实验验证。总体而言，本综述支持将ASK1作为开发新型癌症治疗策略的有希望的分子靶点。

1. 引言
1.1. 癌症
癌症是全球过早死亡的第二大原因。癌细胞具有持续增殖信号传导、逃避生长抑制因子、激活侵袭和转移、维持复制永生、诱导血管生成和抵抗细胞凋亡等核心特征。在正常细胞中，生长信号促使细胞从静止状态向增殖状态过渡；而癌细胞则获得了在缺乏典型生长信号时进行增殖的能力。部分癌细胞通过自分泌方式分泌并响应自身产生的生长因子，或刺激肿瘤基质中的正常细胞分泌生长因子。生长因子受体失调是另一种机制，如表皮生长因子受体（EGFR）家族蛋白过表达可使癌细胞对低水平生长因子产生过度反应；其结构突变也可在无配体时增加激活并维持增殖信号。此外，SOS-Ras-Raf-MAPK信号级联的失调在癌症中十分常见，约四分之一的肿瘤存在组成型活性Ras突变，导致MAPK信号过度激活。同时，磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）/Akt/mTOR通路的激活也促进了蛋白质合成、持续生长与存活。癌细胞还能无视抗生长信号，如视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）在去磷酸化时可阻滞G1期至S期的细胞周期进展，而癌症中常出现pRb通路的缺陷。TP53基因编码的p53蛋白被称为“基因组守护者”，通过调节DNA修复与细胞凋亡抑制肿瘤。在正常生理下，E3泛素连接酶MDM2结合并低水平维持p53，而缺氧、氧化应激或DNA损伤等则促使p53释放激活。p53功能常在癌症中失调，约半数人类癌症存在TP53功能丧失突变。此外，磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）作为肿瘤抑制因子，通过催化PIP3 3'磷酸基团去磷酸化而负向调节Akt信号。

1.2. 活性氧（ROS）
当细胞内ROS产生与中和能力之间失衡时会发生氧化应激。细胞内ROS主要作为氧化磷酸化、脂肪酸β-氧化及内质网蛋白氧化等生物学过程的副产物产生。酶类抗氧化剂如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx），以及非酶类抗氧化剂（如谷胱甘肽、维生素及硫氧还蛋白）共同构成了抗氧化防御系统，并受核因子红细胞系2相关因子2（Nrf2）转录因子的调节。ROS在癌症病理生理中的作用呈浓度依赖性：中等水平通过激活PI3K/Akt、MAPK和NFκB等促生存通路促进增殖和血管生成等；当超过抗氧化容量时，ROS对蛋白质、脂质和核酸造成损伤，导致蛋白质折叠受损、内质网中错误折叠蛋白累积并激活未折叠蛋白反应（UPR），引发线粒体ROS产生的循环，进而触发细胞凋亡。由于代谢异常，癌细胞具有更高的基础ROS水平，因而对进一步的ROS升高尤为敏感。

1.3. 凋亡信号调节激酶1（ASK1）
ASK1是一种含有N端硫氧还蛋白（TRX）结合结构域、中央调控区、丝氨酸/苏氨酸激酶结构域及C端卷曲螺旋区的蛋白。在无应激时，ASK1处于失活状态。TRX结合其N端并促进其泛素化降解，14-3-3蛋白也通过结合pS967位点来抑制其活性。在氧化应激下，TRX从ASK1解离且S967去磷酸化，导致14-3-3蛋白脱落。随后，肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF2/6）被募集至ASK1，促进ASK1 N端同源寡聚化及自磷酸化。激活的ASK1进而磷酸化并激活MKK4/7和MKK3/6，分别导致下游JNK和p38的激活。JNK和p38激活促凋亡蛋白Bax和Bim并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2与Bcl-xL，增加线粒体外膜通透性（MOMP），释放凋亡因子并启动凋亡。此外，UPR亦能独立于氧化应激激活ASK1。内质网应激导致错误折叠蛋白累积，激活IRE1α、PERK和ATF6。IRE1α募集TRAF2形成IRE1α-TRAF2-ASK1复合物，驱动JNK激活与凋亡；PERK则诱导转录因子CHOP表达促凋亡基因。内质网通过与线粒体相关膜（MAMs）将Ca²⁺转移至线粒体，破坏电子传递链并增加ROS，反向激活ASK1。Ca²⁺信号亦可通过Ca²⁺/钙调蛋白依赖性激酶II（CaMKII）在T845位点磷酸化ASK1。研究表明，ASK1在胃癌和非小细胞肺癌（NSCLC）中具有抑制增殖和迁移的作用，但在某些组织如胰腺癌中，ASK1可能表现出生存和促癌特性。

2. ASK1作为抗癌靶点的证据
2.1. ASK1在体外介导肺癌与间皮瘤的抗癌作用
在A549 NSCLC细胞中，纳米银颗粒诱导细胞内ROS增加并伴随ASK1、JNK及p38磷酸化水平的提高，从而引发细胞凋亡。植物化学物质吲哚-3-甲醇处理后，H1299细胞ROS水平显著升高，并伴随c-PARP、c-casp-3和γ-H2AX等水平增加，而抗氧化剂NAC可逆转这些效应，表明其通过ROS和ASK1激活介导凋亡。异喹啉生物碱小檗碱（BBR）刺激A549和PC9细胞增加ROS生成，在Thr845位点磷酸化激活ASK1及下游JNK，该促进凋亡作用同样被NAC阻断。合成化合物(E)-2-(2-氯苯乙烯基)-3,5,6-三甲基吡嗪（CSTMP）通过诱导内质网应激，上调GRP78、CHOP等标志物，并形成IRE1α-TRAF2-ASK1复合物触发JNK介导的凋亡。大豆异黄酮黄豆苷元联合吉非替尼处理后，增加了线粒体与细胞ROS，导致ASK1与JNK激活，并通过抑制EGFR通路等发挥协同促凋亡作用。墨旱莲皂苷A处理H460和H1975细胞在激活ASK1和JNK的同时诱导自噬与凋亡，GS-4997阻断ASK1后可大幅逆转这些作用。从石斛中分离的联苄类化合物Denbinobin在野生型A549细胞中增加ROS并激活ASK1-JNK-c-Jun级联反应，上调Bim表达；而在ASK1显性负突变体或抗氧化剂存在下，其促凋亡作用受到明显抑制。此外，二花生四烯酰基磷脂酰乙醇胺（DAPE）诱导间皮瘤H28细胞产生NOX依赖性ROS，抑制硫氧还蛋白还原酶（TrxR）并促使Trx与ASK1解离，在Thr845位点激活ASK1及其下游p38，诱发不依赖半胱天冬酶的细胞凋亡。

2.2. ASK1在体外介导乳腺与妇科癌症的抗癌作用
藤黄果中提取的Cambogin可提升乳腺癌细胞内ROS水平，增加Bax/Bcl-2比例，激活ASK1及其下游MKK4/7，诱导伴随AIF核转位的不依赖半胱天冬酶的凋亡，且该作用被NAC消除。在MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌细胞中，雷公藤甲素能诱发生成大量ROS，抑制Trx-1活性并使ASK1在Thr845位点磷酸化。同时间引起JNK和p38磷酸化及自噬标志物表达上调，阻断ASK1或JNK均可减弱其引发的凋亡与自噬。姜黄素处理被错误鉴定为胃癌细胞的HeLa衍生细胞后，细胞内ROS水平升高、GSH/GSSG比值下降，并诱导了依赖于ROS的ASK1-MKK4-JNK磷酸化级联及凋亡过程。在MCF-7细胞中过表达的密蛋白6（CLDN6）通过降低ASK1在S967位点的抑制性磷酸化，上调RIP1蛋白并激活ASK1-JNK/p38信号，下调Bcl-2与上调Bax表达，最终促进了caspase-3的激活与细胞凋亡；使用ASK1抑制剂TRX1可逆转上述现象。此外，敲低乳腺癌细胞内高表达的丙酮酸脱氢酶激酶同工酶4（PDK4）可提升细胞内ROS水平，激活ASK1/JNK通路，促进自噬依赖的铁死亡。在宫颈癌细胞中，α-山竹素诱导ROS积累并伴随线粒体膜电位下降，上调Bax表达并诱导caspase级联激活；α-山竹素以浓度依赖方式激活ASK1和MKK3/6及p38，siRNA敲减上述激酶均可阻断其促凋亡作用。在低糖条件下使用二甲双胍作用于卵巢癌细胞，可导致ER应激相关蛋白Grp78和CHOP显著上调，增加Noxa表达并激活ASK1和JNK，最终引起线粒体损伤及依赖ER应激的细胞凋亡；NQDI-1或siRNA阻断ASK1均可大幅消除上述反应。

2.3. ASK1在体外介导胃肠道癌症的抗癌作用
在SNU-213胰腺腺癌细胞中，柚皮素显著激发胞内ROS积聚，下调Prdx-1表达，并伴随ASK1、JNK、p38和p53的磷酸化激活，导致线粒体细胞色素c释放及半胱天冬酶的后续切割，从而触发细胞凋亡。Erianin直接靶向结合AKT和ASK1，抑制SW1990与L3.7胰腺癌细胞的增殖与迁移并引发G2/M期阻滞。它通过抑制AKT/FOXO信号通路同时激活ASK1/JNK/p38 MAPK通路，最终引发ROS产生及大量细胞凋亡。香草醛通过抑制烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）在HT-29和SW480结肠腺癌中蓄积ROS并激活ASK1/p38信号，从而促进p53介导的半胱天冬酶切割与凋亡。此外，在NNMT表达较低的细胞系中，该作用被削弱。热休克蛋白辅因子ST13则可通过直接激活ASK1和JNK以及下游的c-Jun，诱导HCT116结肠癌细胞色素c释放和caspase-3切割。常压气等离子体（AGP）照射通过大幅提高胞内活性氧，在Caco2和HCT116等多株结直肠癌细胞中促使ASK1和p38发生明显磷酸化而诱导凋亡，而敲低ASK1则可显著遏制这种增殖抑制效应。顺铂在LoVo等结直肠癌中引起的细胞毒性依赖于胞内ROS上升及miR-20a下调所暴露出的ASK1结合位点。anti-miR-20a可提高ASK1的表达及其磷酸化激活，进而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2并放大经由JNK下游介导的线粒体凋亡。

2.4. ASK1作为抗癌靶点的体内证据
异种移植模型亦支持ASK1在抗癌作用中的机制。H460荷瘤小鼠经墨旱莲皂苷A给药后，肿瘤体积显著缩小。BBR处理A549移植瘤小鼠后，肿瘤组织中p-ASK1(Thr845)与p-JNK的水平明显上调。NSCLC模型中，黄豆苷元联合吉非替尼的给药降低了肿瘤负荷并提高了总体生存率，且与组织学中的p-ASK1和c-Jun核内积累高度相关。在乳腺癌与妇科癌症方面，经α-山竹素给药的HeLa细胞系荷瘤鼠，以及经雷公藤甲素干预的MDA-MB-231荷瘤鼠的肿瘤生长均受到显著抑制，且组织内ASK1磷酸化同步显著上调。胃肠道模型同样显示顺铂联合anti-miR-20a给药大幅增强了对LoVo异种移植瘤的杀伤力，提高了肿瘤中ASK1的磷酸化水平。Erianin在SW1990荷瘤鼠模型中亦通过上调ASK1下游JNK和p38的磷酸化同时下调ki-67等表达抑制增殖。此外，应用二甲双胍进行干预的SKOV3荷瘤鼠肿瘤生长受到明显抑制，而ASK1抑制剂NQDI-1的应用则在逆转上述作用的同时直接证实了ASK1在二甲双胍介导体内抗癌机制中的核心地位。

3. 结论与展望
综合体外和体内研究证据，ASK1证明了其在应对天然及合成化合物压力下诱导各种实体肿瘤发生细胞凋亡中的作用。尽管各类测试药物性质各异，但它们在激活ASK1后的下游传导机制表现出高度保守的特点：激活MKK4/7和MKK3/6激酶，进而强化下游JNK及p38级联信号，破坏线粒体稳态并诱发半胱天冬酶依赖的细胞死亡过程。异种移植模型进一步证明肿瘤负荷的减少与ASK1的激活密切相关，但采用直接敲低或药理学阻断剂专门针对ASK1的深入体内研究仍亟待扩充。目前文献中激活ASK1的上游机制主要归纳为两条路径：一是化合物的直接刺激诱发大量内源ROS的积聚，导致小分子Trx氧化后从ASK1脱落；二是诱导强烈的内质网应激，形成IRE1α-TRAF2-ASK1大型蛋白复合体。由于内质网与线粒体在功能上的交互作用，这两种上游机制可能在时空中高度协同。此外，尽管本综述指出激活ASK1有助于选择性地消灭癌细胞，但考虑到在正常组织内可能伴随炎症激活与纤维化风险，尤其是当前以Selonsertib（GS-4997）为代表的临床药物实质为ASK1抑制剂的事实，未来在开发靶向ASK1激活策略时必须兼顾其在组织特异性中的两面性，建立对机制多重网络精准调控的能力。