《Antibiotics》：Field Evaluation of the ClaID PCR System Reveals Predominance of Clade I-Associated Molecular Profiles Among Clinical Candida auris Isolates Recovered in ?stanbul, Türkiye
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背景：耳念珠菌（Candida auris）已成为全球性的多重耐药真菌病原体，可导致医疗相关暴发和侵袭性感染。全基因组测序（WGS）研究已证明存在遗传上不同的分支（clade），这些分支在地理分布、抗真菌耐药模式、毒力特征和暴发潜力方面存在差异。目的：本研究旨
背景：耳念珠菌（Candida auris）已成为全球性的多重耐药真菌病原体，可导致医疗相关暴发和侵袭性感染。全基因组测序（WGS）研究已证明存在遗传上不同的分支（clade），这些分支在地理分布、抗真菌耐药模式、毒力特征和暴发潜力方面存在差异。目的：本研究旨在评估ClaID分支识别PCR系统在土耳其伊斯坦布尔收集的临床耳念珠菌分离株中的性能，并调查循环分离株的分支相关分子谱。方法：使用耳念珠菌通用序列（AUS）检测和分支特异性序列检测（CSS1–CSS5）分析44株临床耳念珠菌分离株。根据ClaID框架解释PCR扩增结果。结果：44株分离株中有41株（93.2%）检测到AUS扩增。44株中有39株（88.6%）观察到CSS1扩增，表明在该伊斯坦布尔地区分离株收集中Clade I相关分子谱占主导。使用CSS2、CSS3、CSS4或CSS5检测未观察到扩增。3株分离株AUS阴性，5株分离株尽管反复检测仍未产生CSS1扩增。结论：研究结果表明，来自伊斯坦布尔的大多数分析临床分离株表现出Clade I相关分子谱，而非明确的WGS确认的分支指定。本研究提供了ClaID系统在土耳其临床分离株收集中的首批现场评估之一，并为土耳其耳念珠菌基于PCR的分支相关谱的区域分子流行病学数据做出了贡献。
研究背景与问题提出
耳念珠菌（Candida auris）自2009年在日本首次报道以来，已在六大洲超过50个国家出现，是一种新兴的多重耐药真菌病原体，与医疗相关暴发、长期医院传播及高死亡率的侵袭性感染密切相关。不同于其他念珠菌属（Candida species），耳念珠菌具有显著的环境持久性、高效的人传人能力以及对多类抗真菌药物的频繁耐药性，使得感染预防与控制极具挑战。全基因组测序（Whole-genome sequencing, WGS）研究揭示了耳念珠菌存在五个主要的系统地理分支，即Clade I（南亚）、Clade II（东亚）、Clade III（非洲）、Clade IV（南美）和Clade V（伊朗），这些分支间存在数千个单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms, SNPs），在进化上长期分化，且在抗真菌药敏谱、毒力相关特征、生物膜形成能力、聚集表型、环境持久性和暴发潜力方面存在差异。不同分支的临床流行病学意义不同，如Clade I、III、IV常与大医院暴发和多重耐药表型相关，而Clade II多与耳部感染相关且较少参与医疗传播；此外，ERG11和FKS1的分支特异性耐药突变也有报道，提示分支判定对预测抗真菌药敏趋势具有潜在临床相关性。
尽管WGS是分支判定的金标准，但其应用受成本、基础设施和生物信息学专长的限制。因此，开发了包括多位点序列分型（Multilocus sequence typing, MLST）、短串联重复序列分析和等位基因特异性PCR等替代分子方法。其中Carolus等人开发的等位基因特异性PCR可通过扩增分支特异性遗传标记同时实现物种鉴定和分支判定；近期Narayanan等人开发了ClaID（Clade Identification）框架，一种基于菌落PCR的快速系统，利用比较基因组分析确定的分支特异性基因组区域区分主要分支，随后扩展了CSS5检测以识别Clade V。然而，尽管全球耳念珠菌报告增多，土耳其关于分支分布的分子流行病学数据仍然有限，虽有临床研究记录了土耳其中医疗机构耳念珠菌的出现，但循环分离株的遗传背景和分支组成信息仍稀缺。土耳其近期报告强调耳念珠菌不再局限于散发病例，而是需要协调诊断、临床和感染控制策略的新兴医疗相关病原体，在此背景下快速分支水平分子筛查可补充常规鉴定方法，支持更早识别循环谱系并加强国家监测。因此，本研究旨在评估ClaID PCR系统在土耳其伊斯坦布尔临床耳念珠菌分离株中的性能，调查主要分支分布，并提供ClaID框架在土耳其临床分离株中的首批应用之一，贡献该地区耳念珠菌谱系循环的新的分子流行病学数据。
该研究发表于《Antibiotics》。
主要关键技术方法
研究人员使用了来自土耳其伊斯坦布尔一家三级医院收集的44株非重复临床耳念珠菌（Candida auris）分离株作为研究队列，这些分离株源自标准患者护理过程中的常规临床标本，经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）初步鉴定和内转录间隔区（Internal transcribed spacer, ITS）测序确认。研究人员采用High Pure PCR Template Preparation Kit提取基因组DNA并通过NanoDrop分光光度计评估浓度与纯度（A260/A280比值）。使用ClaID PCR框架，包括物种特异性耳念珠菌通用序列（auris universal sequence, AUS）检测和分支特异性序列检测（Clade-specific sequence assays, CSS1–CSS5），依据Narayanan等人方案进行PCR扩增，反应体系含FIREPol? Master Mix Ready to Load、引物、模板DNA和无核酸酶水，在T100? Thermal Cycler上按特定循环条件扩增（95 °C初始变性5 min，35个循环为95 °C 30 s、 Assay特异性退火温度30 s、72 °C 30 s，末次72 °C延伸5 min）。扩增产物体通过1.5% (w/v) 琼脂糖凝胶电泳在1× Tris–硼酸–EDTA（Tris–borate–EDTA, TBE）缓冲液中100 V运行45–60 min分离，用核酸荧光染料染色后在紫外光下观察并记录，依据预期片段大小解释AUS及CSS1–CSS5扩增结果，AUS阳性视为分子兼容耳念珠菌，CSS对应扩增分别解释为兼容Clade I–V的分子谱，AUS阳性但无CSS扩增者归为ClaID未分配。使用IBM SPSS Statistics version 26.0进行描述性统计分析，计算频数和百分比。
研究结果
3.1. Detection of Candida auris by AUS-PCR
研究人员对44株经MALDI-TOF MS和ITS测序确认的耳念珠菌分离株进行AUS-PCR检测，DNA的A260/A280比值为1.70至1.90，浓度为15.12至38.46 ng/μL。结果显示41株（93.2%）产生预期物种特异性扩增产物，3株（6.8%）反复尝试仍为阴性；AUS阴性分离株的DNA纯度与浓度并未明显低于整体（A260/A280 1.71–1.74，浓度15.12–20.63 ng/μL），提示扩增失败不能明确归因于DNA量不足或纯度差。多数分离株AUS结果与常规鉴定一致，少数先前确认为耳念珠菌的分离株未产生预期扩增信号。
3.2. Clade-Associated Molecular Profiling by ClaID PCR
研究人员用CSS1–CSS5引物集评估分支特异性PCR，44株中39株（88.6%）产生预期CSS1扩增产物，表现为AUS阳性/CSS1阳性的Clade I兼容分子谱；5株（11.4%，编号11、13、23、44和M-152）反复检测未产生CSS1扩增。所有临床分离株均未检测到CSS2、CSS3、CSS4或CSS5扩增产物，即未发现兼容Clade II、III、IV或V的分子谱。阳性对照在所有AUS及CSS1–CSS5检测中均显示预期条带。
3.3. Distribution of ClaID Molecular Profiles
结合AUS与CSS结果，39株（88.6%）为AUS阳性/CSS1阳性，即兼容Clade I的分子谱；2株（4.5%）为AUS阳性但对CSS1–CSS5均无扩增，被ClaID框架归类为未分配；3株（6.8%）未产生AUS扩增而无法进一步分支分析。无分离株显示与Clade II–V相关的扩增模式。AUS阳性/CSS1阳性是最常观察到的ClaID分子谱。
讨论部分总结与研究结论翻译
讨论部分指出耳念珠菌因多重耐药、医疗传播能力、环境持久性及在脆弱人群中致侵袭性感染的重要性，快速分子工具对感染控制和监测愈发重要。WGS显示全球耳念珠菌分为遗传迥异且具有强系统地理模式的分支，分支间在抗真菌耐药、毒力、聚集表型和暴发潜力有差异，故分支鉴定对实用流行病学监测有意义。本研究将ClaID PCR用于44株伊斯坦布尔临床分离株，AUS-PCR检出率93.2%，支持其作为快速分子筛查工具，但3株AUS阴性分离株的DNA指标无明显缺陷，提示可能与引物区序列变异、DNA完整性、抑制剂或靶区降解有关，需谨慎解释并建议重复提取、检测、靶区测序、WGS或替代方法确认。核心发现是CSS1阳性谱占主导（39株兼容Clade I），无CSS2–CSS5扩增，与Clade I在南亚、中东、欧洲等地广泛报告及常与医疗暴发和多重耐药相关的全球流行病学一致；这与土耳其及邻近地区报道常涉及南亚分支谱系、既往WGS和表型研究提示Clade I存在的数据相符，但本研究为单中心伊斯坦布尔地区收集且基于PCR而非WGS，应解释为该地区收集中Clade I相关分子谱占主导，而非土耳其全国分支分布的确证，需更广泛多中心WGS研究明确。无其余CSS扩增提示该收集内分支多样性有限，可能反映单一主导谱系循环，但伊斯坦布尔作为大都市需持续监测以防新谱系引入。5株无CSS1扩增（其中2株AUS阳性/CSS1阴性，3株AUS阴性）可能源于引物结合区变异、靶区结构变异或扩增效率问题，凸显PCR分支分配是快速筛查而非WGS等效，遇不一致谱需确认。纳入CSS5虽未检出Clade V，但对位于欧、亚、中东交汇处的国家可提供更全面监测策略。ClaID PCR相比WGS具成本低、无需复杂基建与生物信息学、周转快、易在常规实验室开展的优势，适合暴发调查和基因组技术受限场景。局限性包括单地区收集不代表全国多样性、分支判定基于PCR而非WGS确认（宜称Clade I相关分子谱而非确证基因组分支）、不一致分离株未做基因组确认、未分析分子谱与药敏及临床结局关联，未来需多中心整合ClaID、WGS、药敏和临床数据验证。
结论部分翻译如下：
总之，本研究对从土耳其伊斯坦布尔一家三级医院回收的44株临床耳念珠菌（Candida auris）分离株进行了ClaID PCR框架的现场评估。大多数分离株表现出AUS阳性/CSS1阳性扩增模式，表明在该地区分离株收集中Clade I相关分子谱占主导。在所分析的临床分离株中未检测到与Clade II、III、IV或V兼容的扩增谱。这些发现支持了ClaID PCR作为一种快速、可及且经济高效的工具，用于耳念珠菌的初步分支相关分子筛查和局部流行病学监测的潜在效用。
然而，由于本研究中分支判定基于PCR扩增谱而非全基因组测序（WGS），结果应解释为分支相关分子谱而非明确的基因组分支指定。AUS阴性和CSS1阴性分离株进一步强调当遇到不一致扩增模式时需要确认方法。未来纳入来自土耳其不同地理区域的更大分离株收集、全基因组测序、抗真菌药敏数据和临床流行病学信息的多中心研究，对于确认循环谱系以及更好地界定耳念珠菌在该国中的临床和感染控制相关性具有重要意义。
