综述：法医体液RNA分型：毛细管电泳与数字PCR技术的效能评估

《Genes》：Forensic Body Fluid RNA Typing: Evaluating the Roles of CE and dPCR Technologies

法医科学中体液识别日益依赖RNA分析方法，因其具备组织特异性，且能提供超越DNA分型的信息价值。在现有RNA检测分析平台中，毛细管电泳(CE)长期作为法医实验室的标准方法，拥有成熟的工作流程与高效的多重检测能力。近年数字PCR(dPCR)研究进展提供了一种高灵敏度替代方案，可在无需标准曲线的情况下实现目标转录本的绝对定量，这对低模板及降解的法医样本尤为有益。本短篇综述聚焦于CE与dPCR工作流程在RNA体液识别中的比较评估，重点探讨分析性能与法医适用性。研究人员对灵敏度、特异性、多重检测能力、RNA降解耐受性及结果判读方法等关键参数进行了批判性评估。CE凭借成熟的设备基础与高通量优势，在多重检测体系设计与常规法医应用中仍具显著优势。相比之下，dPCR展现出更优的灵敏度与定量精密度，尤其在处理疑难法医样本时表现突出，但当前受限于较低的多重检测能力与较高的成本。综述阐明了两种平台的方法学优势与局限，并考察了其用于法医案件检验的适用性。总体而言，现阶段CE与dPCR并非相互竞争的替代关系，而是互补技术，二者的联合或情境依赖性应用可显著提升RNA法医体液识别的稳健性。未来仍需进一步验证与标准化研究，以支持dPCR在常规法医工作流程中的广泛应用。

1. 1.
   Introduction
   犯罪现场生物物证的识别是法医调查的重要组成部分，可为刑事事件重建提供背景信息，并增强DNA分型结果的证据效力。传统体液预筛与确证试验，包括化学法、酶学法及免疫学法，虽长期应用于法医实验室，但普遍存在特异性有限、灵敏度不足或样本消耗量大的缺陷。近年来，以RNA标记物为代表的新型分子技术因转录本的组织特异性表达模式，以及在混合样本中更强的细胞来源鉴别能力，成为极具潜力的替代方案。RNA体液分型已成为法医遗传学的重要分支，可实现单样本同步获取背景信息与遗传信息。目前已鉴定出血液、精液、唾液、阴道分泌物、月经血及直肠黏膜等多种体液组织的特异性mRNA标记物，这些标记物可被整合至多重检测体系中实现并行分析，显著提升法医工作效率。尽管早期研究担忧RNA稳定性问题，但大量实验证实，即使经历环境胁迫或长期保存，法医样本中的RNA仍可保持足够完整性以供分析。Juusola与Ballantyne于2003年开展的奠基性研究证实了信使RNA(mRNA)分型作为传统方法替代方案的潜力，确立了现代RNA法医体液识别的理论基础，证明特定mRNA标记物与不同生物体液存在唯一关联，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)可成功检测组织特异性转录本并准确判定法医斑迹来源。该研究同时表明，mRNA识别可通过多重检测减少样本消耗，并与现有DNA分型流程高效整合，其相较于传统血清学试验具有更高特异性，且可与DNA分析联用，实现单样本同步获取体液来源与供体遗传信息。早期mRNA多重体系为法医RNA分型奠定了分析基础，证实组织特异性转录本在环境胁迫或陈旧样本中仍可检出。
   与DNA甲基化(DNAm)技术相比，RNA分型通常具备更强的组织特异性和更广的多重检测潜力。DNAm分析依赖CpG位点的组织特异性表观遗传修饰，因DNA在法医样本中固有稳定性更高而备受关注。多项协作研究已证实DNAm体液分型与年龄预测的法庭适用性。DNAm标记物在高度降解样本中优势显著，因为甲基化DNA区域在RNA严重降解的条件下仍能留存。此外，DNAm分析可同步提供时序年龄估算等附加情报信息，如靶向ELOVL2位点的相关研究所示。然而，DNAm检测常需亚硫酸氢盐转化步骤，可能导致模板损失并增加流程复杂度，且部分体液标记物的特异性不及转录组特征。相反，mRNA标记物常表现出高度组织限制性表达模式，可改善阴道分泌物与月经血等相近体液的区分能力。
   微RNA(miRNA)技术是另一重要的分子替代方案。miRNA因片段短小且与蛋白复合物结合，在环境胁迫条件下比mRNA稳定性更强，具备法医应用的天然优势。大量研究已验证组织特异性miRNA特征作为体液识别生物标记物的潜力，在不同法医组织与样本条件下均表现出良好的判别性能。但miRNA检测的组织特异性可能低于mRNA分型，因许多miRNA在多种组织或体液中广泛表达，仅存在丰度差异而非绝对特异性。因此，可靠的法医判读通常需要更大规模的标记物组合与多变量分类模型。基于此，联合mRNA与miRNA的策略应运而生，可同时利用mRNA的特异性与miRNA的稳定性优势。
   微生物组体液识别是近年兴起的补充性分子策略，其利用不同身体部位与体液的特征性微生物群落特征。针对唾液、阴道分泌物及其他生物痕迹的研究表明，细菌特征可为体液分类提供有价值的背景信息，尤其在宿主核酸高度降解或含量极低的情形下具备应用潜力。但微生物组成易受环境暴露、个体差异、卫生习惯及时间变化影响，可能降低法医案件检验的重现性与判读可靠性，因此微生物组工作流程的标准化仍是持续挑战。
   高通量测序(MPS)技术显著拓展了RNA法医分型的解析能力。靶向RNA测序可同步检测大规模生物标记物组合，提升低模板样本的灵敏度，并通过编码区SNP分析实现供体关联。与传统CE片段分析相比，测序技术提供更丰富的转录组信息与更强的多重检测能力，但需更复杂的仪器配置、生物信息学分析与验证流程。值得注意的是，RNA测序还支持发现驱动型研究，可通过全转录组或miRNome分析鉴定新型标记物。尽管分子技术不断涌现，RNA分型仍是法医体液识别中最成熟且操作可行的工具之一。欧洲DNA分析工作组(EDNAP)、欧盟法医基因组计划(EUROFORGEN)及法医RNA计划(FoRNAP)等机构开展的大量协作研究，已证实其在多实验室、多样本类型下的重现性、稳健性与适用性。然而，目前尚无单一分子策略能完全满足灵敏度、特异性、降解耐受性、多重检测能力、成本效益及结果易判性等所有法医需求。因此，当前趋势倾向于整合RNA分型与DNAm、微生物组分析及先进测序技术的联合或互补策略，以最大化证据价值并提升法医体液识别的判读置信度。
   RNA体液识别的分析性能高度依赖所采用的检测平台。CE长期以来是法医RNA分型的标准分析方法，其工作流程通常与RT-PCR联用，可实现多重扩增与片段分离，具备较高通量且与现有法医实验室基础设施兼容。CE在法医DNA分析中的广泛应用也促进了RNA分型检测向常规流程的转化。但CE方法主要依赖相对信号判读，在分析低模板、高度降解或混合法医样本时可能存在局限。
   近期，数字PCR(dPCR)成为法医RNA分析的新兴替代技术。与传统PCR不同，dPCR将样本分割为数千个独立反应单元，无需校准曲线即可实现核酸靶标的绝对定量。这种分割策略显著提升了分析灵敏度与精密度，尤其适用于含低量RNA或常见抑制剂的法医物证。此外，dPCR对降解与随机效应表现出更强的耐受性，这对生物物证常受损的法医应用场景极具价值。然而，尽管优势显著，当前dPCR系统在多重检测能力上仍逊于CE平台，且伴随更高的仪器与运行成本。
2. 2.
   Materials and Methods
   本研究文献检索聚焦于采用CE与dPCR技术的法医RNA体液识别工作流程相关出版物。检索数据库涵盖PubMed、ScienceDirect及国际法医遗传学学会(ISFG)会议论文集与科学资源。检索策略与筛选流程如下：检索关键词包括“法医体液识别”“BFID”“RNA分型”“mRNA”“毛细管电泳”“数字PCR”及“微滴数字PCR”，时间跨度为2003年1月至2026年5月。尽管目前已鉴定的法医体液识别dPCR研究均采用微滴数字PCR(ddPCR)，但全文统一使用数字PCR(dPCR)命名，以聚焦RT-PCR CE与dPCR两种方法的比较而非局限于ddPCR平台。初步检索共获PubMed记录146篇、ScienceDirect记录230篇，合计376篇。去重后剩余223篇独特记录进入标题与摘要筛选。排除标准包括：未聚焦法医体液识别；未涉及RNA分型、毛细管电泳、PCR多重体系或数字PCR方法；综述、指南或无原始实验数据的方法学论文；无关法医应用研究；非英文发表文献。最终纳入RT-PCR CE研究25项、dPCR研究6项，相关标记物使用情况经方法与检测体系开发过滤后汇总。同时收集其他技术相关文献以评估法医学界对BFID的关注度，用于绘制2003年1月至2026年5月法医RNA体液识别研究的累积增长趋势图，以便与RT-PCR CE及dPCR技术的发展轨迹进行 contextual 比较。
3. 3.
   Results
   3.1. Research Trends and Biomarker Distribution in Forensic RNA Body Fluid Identification
   出版物趋势与标记物选择模式分析可揭示法医BFID研究的现状与发展倾向。评估特定方法与标记物的研究频次有助于识别主导技术、常用靶标及新兴研究方向。时间演变分析显示，法医RNA BFID研究数量随时间的累积增长反映了该领域的科研关注度持续提升。CE/RT-PCR技术在整个分析周期内始终占据主导地位，且在mRNA分型引入后呈现持续增长态势。相比之下，dPCR相关研究出现较晚，占已发表文献比例较小，表明尽管dPCR关注度逐步上升，但其实际应用仍处于起步阶段。随着微生物组标记物、mRNA标记的MPS测序、编码SNP等技术的发展，dPCR的应用探索仍显不足。
   体液特异性生物标记物的分布分析显示，不同体液的标记物研究覆盖度存在显著差异。部分已确立的组织特异性靶标在多项研究中被反复验证，而另一些标记物出现频率较低，可能为近期提出或验证尚不充分的新候选靶标。唾液识别中，HTN3(dPCR:33%，CE:95%)与STATH(dPCR:33%，CE:81%)始终是最受关注的研究标记物，在RT-PCR CE早期即得到广泛验证，近期逐步转化至dPCR方法，显示出强关联性与灵敏度。月经血识别中，基质金属蛋白酶(MMP)家族成员MMP10(CE:56%)、MMP11(CE:81%)及MMP7(CE:88%)是主要的mRNA靶标，但尚未见dPCR方法研究。皮肤相关标记物虽在文献中有所描述(8项研究)，但因皮肤组织普遍存在于多数生物样本，鉴别价值有限，易导致多重体系冗余，故未被纳入主流BFID多重系统，当前面板更倾向于选择组织特异性强、证据相关性高的体液区分标记物。
   标记物使用分布还体现出方法学差异：血液标记物中，dPCR技术偏好microRNA mir-451a(dPCR:100%)，而RT-PCR CE则广泛使用多种标记物，略倾向于HBB(65%)。精液标记物呈现类似模式，dPCR中最常用mir-891a(dPCR:75%，CE:5%)，其次为经典标记物SEMG1(dPCR:25%，CE:60%)、PRM2(dPCR:25%，CE:45%)及TGM4(dPCR:25%，CE:15%)，PRM1(75%)与KLK3(25%)在RT-PCR CE中也较常见。阴道黏膜的三大核心标记物为MUC4(CE:68%)、CY2B7P1(CE:53%)与HBD-1(CE:42%)。直肠黏膜作为男性性侵案件中的重要识别靶标，其标记物研究尚处探索阶段，各标记物在CE中的使用率均为50%。作为新兴BFID技术，dPCR不仅靶向体液种类较少，且测试标记物数量有限，明显偏好miRNA——因其长度仅18-24核苷酸，稳定性更高，更适配dPCR的设计与检测逻辑。总体而言，文献已提供丰富的mRNA与miRNA标记物资源，法医实验室可根据具体需求、样本特征及常规流程灵活选择优化标记物组合。

3.2. Capillary Electrophoresis vs. Digital PCR Workflows

CE-based RNA分型仍是法医体液识别最成熟的分析方法。典型CE工作流程中，体液特异性转录本经荧光标记引物逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增后，通过CE按片段大小分离扩增产物，最终通过电泳图谱分析实现单反应多标记物同步可视化。多重RT-PCR体系的持续优化推动了标记物面板的扩展与通量提升，促进了法医实验室的落地应用，目前已开发出包含直肠黏膜标记物等新增生物标志物的扩展多重体系。miRNA等替代RNA类别的整合进一步拓宽了可检测标记物范围，改善了环境胁迫条件下的检测性能。但CE方法本质为半定量分析，结果判读依赖电泳峰形与阈值信号评估而非直接分子定量，导致判读标准可能因工作流程与实验室而异，尤其在弱信号、混合样本或受损生物物证的评估中存在挑战。痕量RNA灵敏度不足及复杂体液混合物解析困难仍是常规法医应用的重要局限。

dPCR通过将样本分割为数千个独立微反应单元，实现了核酸靶标的绝对定量，成为极具潜力的替代技术。扩增后，每个分区根据荧光信号强度被归类为阳性或阴性，靶标浓度通过泊松统计模型计算。与CE片段分析不同，dPCR无需校准曲线或电泳峰判读即可直接测量转录本拷贝数。其核心优势在于更高的分析灵敏度与定量精密度，多项研究证实其在低拷贝靶标检测、PCR抑制剂耐受性及降解/低模板法医样本分析中表现更优。分区扩增还可减少模板竞争与扩增偏倚，有望改善低丰度转录本与复杂样本中次要贡献者的识别能力。近期ddPCR平台研究已成功实现体液标记物同步识别，并优化了RNA降解评估方案。但dPCR的广泛应用仍受限于多重检测能力较低、仪器专业化要求高及运行成本较高等问题。此外，法医验证研究相对匮乏，上游逆转录过程引入的变异仍可能影响定量准确性。总体而言，CE与dPCR是互补而非竞争的分析策略：CE凭借成熟落地基础与多重检测能力，仍适用于常规高通量场景；dPCR则在痕量、降解或富含抑制剂的疑难法医样本中具备独特优势。未来需在标准化法医条件下开展更多比较研究，以明确两种技术在RNA分析流程中的最优应用场景与整合路径。

3.3. Forensic Applicability and Casework Relevance

法医分析方法的适用性取决于其从案件类样本中生成可靠、可判读结果的能力。犯罪现场生物痕迹常含低量核酸，易受环境降解或抑制物影响，且多为多供体混合样本，体液比例失衡现象在性侵案件中尤为突出。这些条件要求分析方法具备稳健的结果产出能力与可靠的判读支持，同时满足证据采纳标准。dPCR的定量能力在低丰度靶标或高度不平衡混合样本中优势显著，分区扩增可提升微量转录本群体的检出率，助力复杂生物混合物判读，这对精斑与上皮RNA比例悬殊的性侵案件尤为重要。

数据判读领域的最新进展凸显了机器学习(ML)在BFID分析中的应用潜力。ML分类模型在dPCR数据集上表现出高精度，这可能与绝对定量带来的随机变异降低有关。类似方法也改善了CE RT-PCR数据的判读，尤其在纳入定量信息与混合样本训练时效果显著。这些进展表明，先进计算方法可提升不同分析平台的BFID判读水平。

从案件应用视角看，CE与dPCR体液识别均可提供法医斑迹生物来源的关键背景信息，辅助犯罪现场重建、支持或反驳行为层面假设，并指导后续DNA分析策略。未来发展将聚焦于标准化提升、概率性判读框架构建及计算方法整合，进一步提升RNA体液识别的证据价值与实用效能。

1. 4.
   Future Perspectives and Conclusions
   法医RNA体液识别的未来进展将由方法学标准化推进、分子标记物集扩展及新一代平台整合共同驱动。尽管CE RNA分型仍是常规法医实验室最成熟、验证最充分的技术，dPCR正逐步发展为互补性技术。推动dPCR在法医案件中广泛应用的核心前提是系统性验证与实验室间标准化。与受益于大量协作研究与长期常规应用的CE系统不同，dPCR法医RNA应用仍处于验证不足阶段，亟需制定涵盖检测设计、判读阈值、报告规范与质量保证框架的统一指南。此外，RNA提取效率与逆转录变异性等前分析因素仍是重要的分析变异来源，需在后续验证研究中细致评估。结构化多实验室协作研究对确保重现性与法医稳健性至关重要。
   未来发展与日益增长的RNA标记物体系密切相关。组织特异性转录组数据集的扩充支持更具判别力与定量性的标记物面板开发，包括mRNA、miRNA及其他小RNA种类，这些标记物尤其适配dPCR工作流程的绝对定量需求与降解样本分析优势。在此背景下，标记物选择预计将从定性分类转向基于转录本丰度阈值与概率性判读模型的定量决策框架。与此同时，MPS技术的显著进步将进一步推动BFID发展。靶向RNA测序已实现大规模生物标记物面板同步分析与转录组变异的高分辨率解析，且支持新型组织特异性标记物的鉴定与法医斑迹转录组复杂性的认知深化。RNA测序与DNA分析（包括编码区SNP）的整合能力，还可实现同一样本的体液识别与供体归因。
   测序化学、文库制备与生物信息学的进步有望进一步提升灵敏度、降低成本并改善疑难法医样本的兼容性。除RNA技术发展外，DNA法医技术也在持续演进并补充RNA分型策略。DNA甲基化分析的进展拓展了法医痕迹的生物信息获取维度，不仅支持体液识别，还可推断时序年龄等信息。甲基化方法尤其在与高通量测序或dPCR平台联用时，为RNA降解限制转录组分析的案件提供了多维判读的潜在方案。但亚硫酸氢盐转化导致的DNA损失与标记物特异性灵敏度限制仍是常规应用的重要挑战。
   总体而言，法医体液识别的未来格局将迈向整合RNA分型、DNA甲基化分析、微生物特征与测序技术的多组学框架。在此框架下，CE方法仍将作为快速多重筛查的核心手段，而dPCR与MPS平台则在灵敏度、定量能力与信息深度上提供互补优势。这些技术的融合，辅以标准化提升与生物信息学判读工具的完善，对最大化证据价值（如背景信息）及提升复杂法医案件的稳健性至关重要。