基于CHO细胞真核表达gD蛋白的牛传染性鼻气管炎间接ELISA建立

《Veterinary Sciences》：Establishment of an Indirect ELISA for Bovine Infectious Rhinotracheitis Based on Eukaryotic Expression of gD Protein in CHO Cells

为开发用于检测牛疱疹病毒1型（BoHV-1）血清抗体的间接ELISA试剂盒，研究人员在CHO-S细胞中表达了BoHV-1的gD蛋白，并纯化后用作包被抗原。优化后的条件如下：包被抗原浓度为2 μg/mL；血清稀释度为1:40，37 °C孵育60 min；酶标抗体稀释度为1:5000，37 °C孵育60 min；使用TMB底物在37 °C显色15 min。然后用酶标仪测定吸光度。该试剂盒可检测稀释至1:3200的BoHV-1阳性血清，显示出良好的分析检测能力。与牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、阿卡斑病毒（AKAV）、牛副流感病毒3型（BPIV3）或牛结节性皮肤病病毒（LSDV）的阳性血清均未观察到交叉反应，反映了理想的分析特异性。基于126份田间血清样本，与商业IDEXX gB ELISA试剂盒进行对比测试，研究人员进一步计算了诊断敏感性（83.54%；95% CI: 73.22–90.17%）和诊断特异性（100%；95% CI: 92.43–100%），以定量表征其临床检测性能。基于IDEXX gB血清状态而非真正经VNT确认的感染进行的ROC曲线分析，得出AUC为0.912（95% CI: 0.856–0.951），这仅反映检测间一致性而非绝对诊断有效性。该间接ELISA可应用于流行病学调查和免疫效果评估。

**论文解读：基于CHO细胞真核表达gD蛋白的牛传染性鼻气管炎间接ELISA建立**

**研究背景与问题**

牛传染性鼻气管炎（IBR）由牛疱疹病毒1型（BoHV-1）引起，对全球养牛业造成重大经济损失。该病毒属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科水痘病毒属，感染后可引起呼吸道疾病、流产、不孕及结膜炎等，导致生产性能下降和贸易限制。尽管部分欧洲国家通过检测-扑杀策略和标记疫苗接种实施根除计划，BoHV-1在全球许多地区仍呈地方性流行，尤其在生物安全措施执行不力的高密度养殖系统中。BoHV-1的生物学特性使疾病控制复杂化：原发感染后病毒在感觉神经元中建立终身潜伏期，在应激或免疫抑制下可周期性再激活并排毒，导致羊群内隐性传播，难以完全根除。因此，通过准确的血清学监测早期发现感染动物是IBR控制计划的基石。目前商业ELISA试剂盒（如IDEXX IBR gB X3抗体检测试剂盒）虽经病毒中和试验（VNT）验证具有高诊断性能，但价格昂贵，限制了在资源有限地区的规模化应用。此前研究多采用大肠杆菌或杆状病毒表达系统生产gD蛋白，但这些平台常导致蛋白质翻译后修饰不完整，可能损害抗原性和分析灵敏度。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是复杂治疗性糖蛋白工业生产的首选宿主，能提供真实的哺乳动物翻译后修饰（如复杂N-糖基化），但CHO细胞表达的gD用于BoHV-1血清学诊断尚未被探索。针对上述问题，研究人员开展了本研究，旨在利用CHO-S细胞真核表达密码子优化的BoHV-1 gD蛋白，建立一种低成本、可靠的间接ELISA方法，用于大规模牧场筛查和免疫效果评估。该研究在《Veterinary Sciences》期刊发表。

**主要技术方法**

研究人员采用了以下关键技术方法：首先，基于NCBI数据库BoHV-1 gD基因序列（GenBank登录号JN787954.1）进行密码子优化以匹配CHO细胞表达偏好，合成并构建重组真核表达载体pcDNA3.1(-)-BoHV-1-gD。其次，将重组质粒转染至CHO-S细胞，通过SDS-PAGE和Western blot验证表达及免疫反应性，并利用Ni-亲和层析纯化His标签融合蛋白。再次，建立间接ELISA体系，通过棋盘滴定优化包被抗原浓度、血清稀释度、封闭液、酶标抗体稀释度和显色时间等关键参数。最后，以74份确诊BoHV-1阴性血清确定临界值（cut-off），并利用126份田间血清样本（随机采集自内蒙古巴彦淖尔市奶牛群，包括无症状潜伏携带者、疫苗接种牛和未接种育肥牛，时间2025年3月至8月）进行平行对比测试，以商业IDEXX IBR gB X3 ELISA试剂盒为参考标准，计算诊断敏感性、特异性及一致性，并进行ROC曲线分析。

**研究结果**

**3.1 gD蛋白的表达与纯化**
Western blot检测显示，在细胞培养上清中约57 kDa处出现特异性条带，证实重组gD蛋白具有免疫反应性。Ni-柱纯化后SDS-PAGE显示57 kDa处单一主带，表明蛋白纯化成功。

**3.2 间接ELISA方法的建立**
通过棋盘滴定和参数优化，确定最佳反应体系：包被抗原浓度2 μg/mL，血清稀释度1:40，酶标抗体稀释度1:5000，5%脱脂乳封闭，TMB显色15 min（37 °C）。

**3.3 临界值的确定**
基于74份阴性血清的S/P值，计算平均值为0.0150，标准差（SD）为0.0512，临界值定义为平均值+3SD，即S/P ≥ 0.1686判为阳性，<0.1686判为阴性。以IDEXX gB血清结果为参考标准（非VNT确认的感染状态）进行ROC分析，AUC为0.912（95% CI: 0.856–0.951），反映两个ELISA平台间的一致性而非独立诊断性能。

**3.4 分析交叉反应性（分析特异性）**
对BVDV、AKAV、BPIV3和LSDV阳性血清的检测结果均未出现升高的OD/S/P信号，证明该ELISA具有理想的分析特异性，无交叉反应。

**3.5 分析检测限（分析灵敏度）**
阳性血清稀释至1:3200时，S/P值仍高于临界值，表明该检测方法具有优异的分析检测能力。

**3.6 重复性实验**
批内最大变异系数（CV）为8.8%，批间最大CV为8.85%，均低于10%阈值，显示稳定性良好的重复性。

**3.7 符合率试验结果**
126份田间血清的平行检测结果：真阳性（TP）=66，假阴性（FN）=13，真阴性（TN）=47，假阳性（FP）=0。计算诊断敏感性为83.54%（95% CI: 73.22–90.17%），诊断特异性为100%（95% CI: 92.43–100%），总体样本符合率为89.68%。所有13份不一致样本均为IDEXX gB阳性而gD ELISA阴性，在该比较系统中被定义为假阴性。

**讨论与结论总结**

讨论部分指出，BoHV-1的潜伏感染特性使根除极为困难，疫苗接种虽为主要防控手段，但无法阻止潜伏感染建立。早期准确诊断至关重要，VNT虽为金标准但需活病毒和复杂设备，ELISA更适用于大规模筛查。gD糖蛋白在诊断中具有关键优势：结构保守、诱导中和抗体和细胞免疫反应。本研究利用CHO细胞表达的gD理论上具有更完整的糖基化修饰，优于原核表达系统。开发的ELISA展示了可靠的分析性能，但通过与IDEXX gB试剂盒对比，诊断敏感性仅为83.54%，存在假阴性风险，尤其在低流行率牛群中更易漏检潜伏携带者。该研究未使用VNT作为金标准，因此AUC和诊断指标仅反映方法间一致性而非绝对诊断能力；未进行糖蛋白组学测序验证糖基化模式；交叉反应病原体面板仅涵盖四种病毒，未包括牛呼吸道合胞病毒（BRSV）和牛冠状病毒（BCoV）等共感染因子。尽管如此，该间接ELISA成本低、操作简便，可作为中国牛群IBR流行病学监测和疫苗免疫效果评估的补充筛查工具。

**结论**
本研究成功在CHO-S细胞中表达了BoHV-1 gD蛋白，并以纯化gD作为包被抗原建立了间接ELISA。经系统参数优化，确认最佳反应体系为：包被抗原2 μg/mL，血清稀释度1:40，二抗1:5000，5%脱脂乳封闭，TMB显色15 min（37 °C）。该ELISA具有良好分析检测能力（阳性血清稀释极限1:3200），与四种异源牛病毒血清无交叉反应。与IDEXX gB ELISA定量比较，诊断敏感性为83.54%（95% CI: 73.22–90.17%），诊断特异性为100%（95% CI: 92.43–100%）。批内和批间变异系数均小于10%，显示重复性稳定。126份临床血清样本与商业试剂盒符合率达89.68%。总之，这种低成本、操作简便的间接ELISA适用于IBR日常血清学监测和免疫效果评估，但需注意其中等诊断敏感性及在低流行率牛群中相关的假阴性风险。