CRISPR/Cas9辅助的异宗配合转化使工业酿酒酵母菌株的快速杂交成为可能

《Bioresource Technology》：CRISPR/Cas9-assisted heterothallic conversion enables rapid hybridization of industrial Saccharomyces strains

育种被广泛用于改善酵母在食品和生物技术应用中的性能。传统育种程序对于同宗配合（homothallic）菌株具有不可预测的持续时间。CRISPR辅助的异宗配合（heterothallic）转化能够产生稳定的单倍体（haploid）菌株。种内和种间杂种（hybrids）可以很容易地通过单倍体杂交产生。通常需要三个月来完成CRISPR辅助的酵母育种。

**CRISPR/Cas9辅助的异宗配合转化实现工业酿酒酵母菌株快速杂交的研究解读**

**研究背景、问题与目的**

酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）是食品和工业生物技术领域的核心微生物，广泛应用于酒精饮料、生物燃料和高价值生化品的生产。工业菌株多为同宗配合（homothallic）二倍体，能够通过*HO*基因编码的核酸内切酶进行交配型转换，自发二倍化，这为进化提供了稳健性，但同时也给定向杂交育种带来了巨大挑战。传统杂交方法（如孢子-孢子杂交、稀有交配、群体交配）在应用于同宗配合菌株时，面临孢子活力低、交配型未知、操作繁琐且耗时不可预测等问题，严重限制了遗传多样性的快速探索和优良性状的组合。当前存在一个关键瓶颈：缺乏快速、高效且广泛适用的方法，能够从同宗配合二倍体工业菌株中生成并评价目标杂种。为此，研究人员开展了本研究，旨在利用CRISPR/Cas9技术对*HO*基因进行编辑，将同宗配合菌株转化为稳定的异宗配合（heterothallic）菌株，从而可控地分离单倍体（haploid）并实现快速杂交，以加速工业酵母育种进程。该论文发表在《Bioresource Technology》。

**主要关键技术方法**

研究采用的关键技术包括：1）CRISPR/Cas9基因组编辑，使用pMEL13衍生质粒共表达SpCas9核酸酶和靶向*HO*基因的引导RNA（guide RNA），同时引入携带显性选择标记（NrsR或HygR）的供体双链DNA（dsDNA），通过同源重组修复实现*HO*基因的破坏；2）孢子解剖与单倍体分离，通过四分子解剖（tetrad dissection）获得单倍体孢子，并利用与已知交配型测试菌株杂交的方法确定交配型；3）单倍体杂交，将相反交配型的单倍体细胞混合，在双抗生素选择培养基上筛选二倍体杂种；4）微发酵分析，使用ANKOM^RF气体生产系统监测CO₂产生以评估发酵动力学；5）化学分析，采用高效液相色谱（HPLC）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）测定代谢物。样本队列来源：十株商业酿酒酵母菌株，均来自Italiana Biotecnologie Srl（意大利特雷卡泰-诺瓦拉）的专有菌株库，这些菌株分离自不同葡萄品种和地理起源。

**研究结果**

**3.1 第一次杂交：降低SO₂产量**
研究人员选取IB01（高SO₂产生菌株）和IB02（低SO₂产生菌株）作为亲本，通过CRISPR/Cas9破坏*HO*基因获得异宗配合二倍体（IB01-Δho和IB02-Δho）。微发酵实验表明*HO*失活不影响发酵动力学和SO₂产量。随后诱导孢子形成，分离单倍体，并挑选四个单倍体评估发酵性能，结果显示单倍体保留亲本特性。通过将单倍体杂交，生成八个杂种（Hy1x2.1–8），在天然葡萄汁中发酵后，其中四个杂种表现出低SO₂表型，与IB1x2参考杂种一致，且SO₂水平与乙醛产量相关。整个杂交与评价过程在三个月内完成，而传统方法需三十个月。

**3.2 酵母基因组编辑**
通过CRISPR/Cas9在高产乙酸菌株IB03和低产乙酸菌株IB04中成功破坏*HO*基因，获得异宗配合菌株。孢子解剖后分离单倍体，微发酵显示单倍体乙酸产量高于二倍体，提示倍性影响代谢。生成八个杂种（Hy3x4.1–8），在天然葡萄汁中发酵后，所有杂种乙酸产量介于亲本之间，平均降低约20%，且多数杂种继承了IB04的高效果糖利用能力。

**3.3 第三次杂交：重启停滞发酵**
以铜耐受菌株IB05与可重启停滞发酵但对铜敏感的IB06为亲本，破坏*HO*基因后分离单倍体。微发酵显示单倍体保留亲本发酵特性。生成八个杂种（Hy5x6.1–8），铜耐受性筛选显示半数杂种铜抗性高于IB06，其中三个杂种在模拟停滞发酵实验中表现出与IB06相当的发酵性能，成功结合了铜耐受与重启发酵能力。

**3.4 杂种分子顺基因改造**
为实现顺基因（cisgenic）状态，研究人员在亲本*HO*破坏时引入含独特23 bp序列（最小切割序列，MCS）的标记。在杂种中再次使用CRISPR/Cas9，以MCS为靶点，以天然*HO*基因为供体DNA，成功切除外源标记并恢复*HO*基因。随机选取IB07和IB08菌株验证，顺基因杂种恢复同宗配合和孢子形成能力，且对抗生素敏感，整个顺基因改造过程仅需四周。

**3.5 种间杂交**
将CRISPR/Cas9方法扩展至*S. cerevisiae*（IB09）与*S. uvarum*（IBUV）的种间杂交。由于*S. uvarum*的*HO*基因序列差异，需设计物种特异性引导RNA。破坏*HO*后分离单倍体，生成八个种间杂种（Hy9xUV.1–8）。发酵动力学显示杂种与亲本相似，但代谢物组合了双亲特性，如部分杂种乙酸产量中等、SO₂和乙醛降低。进一步通过顺基因改造恢复*HO*基因，种间杂种虽能孢子形成但孢子活力严重受损，表明不育性。发酵实验显示顺基因与转基因杂种性能一致。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究开发的CRISPR/Cas9辅助育种策略通过瞬时破坏*HO*基因，将同宗配合菌株转化为稳定异宗配合衍生物，克服了传统杂交中单倍体分离困难、操作耗时且结局不确定的局限。该方法允许在杂交前对单倍体进行表型表征和选择，实现理性定向杂交，大幅减少需筛选的杂种数量，且适用于孢子形成率和活力低的工业菌株。关键技术进步是鉴定了一个在十株天然酿酒酵母中均有效的CRISPR/Cas9靶向位点，显示方法的可扩展性。三个案例验证了方法的实用性，杂种表型可呈现亲本性状、中间行为或组合优势，且与常规杂交产生的杂种无差异。顺基因改造通过引入MCS序列实现了外源标记的完全切除，恢复了同宗配合能力，且CRISPR/Cas9编辑不影响发酵性能。种间杂交进一步证明方法的通用性，尽管性状组合未达最优，但发酵性能保留。研究结论（5. Conclusions）指出：本研究将CRISPR/Cas9辅助的异宗配合转化定位为一种快速、决策导向的酵母育种通用平台，结合了速度、精确性和多功能性，是工业与实验微生物遗传学工具箱的重要补充。该工作展示了如何将精准基因组编辑与经典育种概念整合，以现代化菌株开发流程，同时保留自然酵母多样性的进化与功能丰富性。