附睾上皮细胞的时空动力学揭示小鼠出生后发育中一种新的KRT5+ATP6V1A+基底细胞亚群

《European Journal of Cell Biology》：Spatiotemporal Dynamics of Epididymal Epithelial Cells Uncover a Novel KRT5?ATP6V1A? Subpopulation of Basal Cell in Postnatal Mouse Development

附睾上皮细胞对精子成熟至关重要。尽管先前的研究已经确定了大鼠附睾中附睾上皮细胞的发育，但小鼠附睾中不同上皮细胞类型的出生后发育轨迹仍不清楚。在此，研究人员通过共聚焦免疫染色和单细胞RNA测序（scRNA-seq）检查了小鼠附睾上皮的发育时间线，发现其与大鼠不同。在小鼠中，主细胞和基底细胞早在出生后第7天（PD7）就出现在所有节段，由AQP9和KRT5标记，而大鼠中出现较晚（例如，大鼠附睾尾中基底细胞在PD14出现）。ATP6V1A阳性的亮细胞在出生后第28天（PD28）在附睾头（caput）、附睾体（corpus）和附睾尾（cauda）中被检测到，但不在初始段（initial segment）中，而窄细胞从PD14开始在所有节段中被观察到。这与大鼠形成对比，在大鼠中亮细胞在PD14出现。值得注意的是，scRNA-seq和免疫染色鉴定了一个以前未被认识的KRT5⁺/ATP6V1A⁺窄样基底细胞亚群，其富含溶酶体，主要定位于附睾头和附睾体。这些发现揭示了小鼠与大鼠相比更早的上皮成熟，强调了选择动物模型的重要性。新鉴定的基底细胞亚群可能有助于管腔酸化和稳态，为附睾生理学和生殖生物学提供了新的见解。

**论文解读：附睾上皮细胞的时空动力学揭示小鼠出生后发育中一种新的KRT5⁺ATP6V1A⁺基底细胞亚群**

**研究背景与问题**

附睾是雄性生殖系统中精子成熟的关键器官，其上皮细胞通过分泌和吸收功能维持管腔微环境，确保精子获得运动能力和储存稳定。附睾上皮主要由主细胞（principal cell）、基底细胞（basal cell）、亮细胞（clear cell）、窄细胞（narrow cell）、顶细胞（apical cell）和晕细胞（halo cell）等组成。既往对大鼠附睾的研究已确立了出生后发育的经典时间框架：未分化阶段（出生后第1–15天）、分化阶段（第16–44天）和扩张阶段（第44天后），并描述了各细胞类型出现的时序与区域特征。然而，小鼠作为现代遗传学、谱系追踪和单细胞基因组学的主要模型，其附睾上皮细胞在出生后发育过程中的具体分化轨迹、种群动态及区域异质性尚未被系统阐明。这一知识空白限制了对小鼠附睾功能成熟机制的理解，也阻碍了与大鼠发育模式的比较，从而影响动物模型选择的科学依据。因此，研究人员开展了本研究，旨在利用先进成像和单细胞转录组技术，描摹小鼠附睾上皮的出生后发育全景，并鉴定可能存在的细胞新亚型。

**研究内容与结论**

本研究利用mTmG膜靶向tdTomato报告小鼠，结合共聚焦免疫荧光染色和单细胞RNA测序（scRNA-seq），系统分析了小鼠附睾各节段（初始段、附睾头、附睾体、附睾尾）从出生后第7天（PD7）至第49天（PD49）的上皮细胞发育动态。主要结论包括：（1）小鼠附睾上皮细胞的出现时间普遍早于大鼠，主细胞和基底细胞在PD7即已出现在所有节段，而大鼠中基底细胞在附睾尾最早见于PD14；（2）主细胞的成熟标志物AQP9从胞质分布向顶膜极化呈远端-近端模式，附睾体/尾在PD14即出现顶膜定位，而初始段和附睾头延迟至PD21–28；（3）ATP6V1A阳性的窄细胞在PD14出现于所有节段，亮细胞则在PD28才出现于附睾头、体、尾，且初始段始终缺失，这与大鼠亮细胞在PD14出现的模式不同；（4）基底细胞形态从PD7的柱状逐渐转变为PD14–21的圆顶状，并在附睾尾形成连续基底网络，部分基底细胞在PD21后延伸出轴突足（axiopodia）接触管腔；（5）通过scRNA-seq和免疫荧光共同鉴定出一个此前未被认识的KRT5⁺ATP6V1A⁺窄样基底细胞亚群，该细胞在PD28达到峰值，主要分布于附睾头和附睾体，富含溶酶体（LAMP1阳性），且其B6亚群富集Atp6v家族基因和Foxi1，提示其可能参与管腔酸化和氨基酸代谢，类似于经典窄细胞或亮细胞的功能。该研究揭示了小鼠附睾上皮成熟的加速和节段特异性模式，强调了大鼠与小鼠在发育时序上的种间差异，为选择合适动物模型提供了重要依据。新发现的KRT5⁺ATP6V1A⁺基底细胞亚群可能为附睾生理学和生殖生物学提供新的认知。论文发表在《European Journal of Cell Biology》。

**主要关键技术方法**

本研究采用mTmG膜靶向tdTomato报告小鼠（来自中国农业大学张华教授），用于细胞形态可视化；共聚焦免疫荧光染色，检测AQP9、KRT5、ATP6V1A、LAMP1等标记物，并结合3D重建；单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据提取自先前研究（Shi et al., 2021），利用Seurat v5.3.1进行聚类分析，Harmony方法整合样本，Slingshot进行伪时间轨迹推断，clusterProfiler进行KEGG通路富集；图像定量分析使用ImageJ/Fiji，统计用GraphPad Prism 10。样本来源：小鼠由南通大学实验动物中心SPF级屏障饲养，动物实验经南通大学动物伦理委员会批准。

**研究结果**

**3.1 验证小鼠附睾中常规上皮细胞标记物**
通过共聚焦免疫荧光在成年小鼠附睾各节段验证了AQP9（主细胞）、KRT5（基底细胞）和ATP6V1A（窄细胞/亮细胞）的特异性表达，确认这些标记物适用于小鼠。

**3.2 发育中附睾主细胞AQP9的区域特异性表达和顶膜极化**
共聚焦免疫荧光显示，PD7时AQP9在全部节段主细胞中呈胞质分布，无顶膜定位。PD14时，附睾体和附睾尾开始出现顶膜富集，而初始段和附睾头仍为胞质型。PD21时，近端区域出现弱顶膜信号，附睾头在PD28达到成年样分布，初始段在PD35–49仍保留胞质信号。定量分析证实了AQP9顶膜极化的远端-近端发育轨迹，与附睾体/尾较早成熟一致。

**3.3 ATP6V1A阳性窄细胞和亮细胞在出生后发育中的分布**
共聚焦成像显示，PD7时ATP6V1A阳性细胞稀少，PD14后数量急剧增加，PD28后稳定。窄细胞呈杯状形态，在PD14后分布于所有节段，初始段、附睾头数量最少，附睾体中等，附睾尾最多，且在PD35初始段达峰值。亮细胞呈柱状，PD28起出现于附睾头、体、尾，初始段始终缺失，PD49时附睾尾中亮细胞比例最高。与大鼠相比，小鼠亮细胞出现更晚（PD28 vs PD14），且窄细胞分布更广。

**3.4 基底细胞的发育模式和形态可塑性**
KRT5阳性基底细胞在PD7即可在所有节段检测到，形态呈柱状，核位于上皮中层，提示分化早期。PD14后基底细胞数量显著增加，形态从柱状逐步转为圆顶状，PD21时近端区域超过80%的基底细胞呈圆顶状，附睾尾在PD14即形成连续基底细胞网络。部分基底细胞在PD21后从初始段延伸出轴突足向管腔，PD35达峰值，PD49减少。细胞体面积定量显示PD7时最大，PD14–21后显著减小。

**3.5 鉴定窄样KRT5⁺ATP6V1A⁺上皮细胞群**
高分辨率共聚焦及3D重建发现一种形态狭长的KRT5⁺窄样细胞，PD14时罕见，PD28达峰值后下降。双标记免疫荧光显示，部分KRT5⁺窄样细胞共表达ATP6V1A（命名为KRT5⁺ATP6V1A⁺基底细胞），主要分布于附睾头（约4.81%）和附睾体（约2.79%），而附睾尾和初始段共定位极低。scRNA-seq数据分析显示，基底细胞可聚类为8个亚群，其中B6亚群高表达Atp6v家族基因和Foxi1，KEGG富集到溶酶体和氨基酸代谢通路。三重免疫荧光证实KRT5⁺ATP6V1A⁺细胞中LAMP1阳性溶酶体面积和强度显著高于KRT5⁺窄样细胞，提示该亚群可能参与溶酶体依赖的酸化和代谢功能。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究系统展示了小鼠附睾上皮细胞出生后发育的时空动态，与大鼠相比，小鼠上皮细胞出现更早（如主细胞和基底细胞PD7 vs 大鼠PD14–21），且区域分布存在差异（如窄细胞在小鼠中分布于所有节段，而大鼠中主要限于初始段）。这些发现强调了种间差异对动物模型选择的重要性。新鉴定的KRT5⁺ATP6V1A⁺窄样基底细胞亚群在PD28达峰值，早于精子进入附睾，提示其可能为一种瞬态过渡状态，参与上皮准备性重塑。该细胞亚群富含溶酶体并表达V-ATP酶（ATP6V1A）和Foxi1，与肺离子细胞（ionocyte）部分分子特征相似，但还表达LAMP1，提示兼有溶酶体功能。在附睾头区域，经典亮细胞较少，而KRT5⁺ATP6V1A⁺细胞富集，研究人员提出一个区域功能补偿模型：该亚群可能替代部分亮细胞角色，参与管腔酸化和稳态维持。研究结论部分翻译如下：综上，本研究发现勾勒了小鼠附睾加速且节段模式化的成熟过程，并激励未来整合单细胞/空间转录组学和谱系追踪的工作，以解析KRT5⁺窄样亚群的起源和功能，并阐明协调AQP9运输和V-ATP酶部署的内分泌-管腔互作，以维持精子静息、成熟和储存。