《Experimental Parasitology》：Preliminary development of monoclonal antibody-based ELISA assays for Ixodes holocyclus paralysis tick holocyclotoxin assessments as an alternative to in vivo approaches
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摘要宠物动物出现瘫痪症状，主要是由澳大利亚东部麻痹蜱Ixodes holocyclus的唾液腺分泌的全环毒素所导致的。这类毒素的传统检测方法是通过体内新生鼠试验来鉴定和定量，虽然结果较为稳定，但存在伦理问题。因此，需要更先进的分析方法来助力抗血清产品的标准化、毒素特性研究，以及开
摘要
宠物动物出现瘫痪症状，主要是由澳大利亚东部麻痹蜱Ixodes holocyclus的唾液腺分泌的全环毒素所导致的。这类毒素的传统检测方法是通过体内新生鼠试验来鉴定和定量，虽然结果较为稳定，但存在伦理问题。因此，需要更先进的分析方法来助力抗血清产品的标准化、毒素特性研究，以及开发新一代治疗宠物瘫痪的药物。研究人员针对HT-1和HT-5的预测B细胞表位，制备了特定的抗全环毒素单克隆抗体。这些抗体通过表面等离子体共振技术进行了特性分析，并被用于构建酶联免疫吸附试验。基于这些单克隆抗体的ELISA检测方法，对HT-1和HT-5的检测具有高灵敏度、重复性和特异性。表面等离子体共振实验结果显示，所选抗体与这些毒素的亲和力很高。优化后的ELISA方法能够在1–60 ng/mL的范围内高效检测HT-1，还能区分不同商业抗蜱血清的毒素中和能力。总体而言，这种利用针对HT-1和HT-5的单克隆抗体的免疫测定方法，为全环毒素的定量提供了重要手段，同时也比体内试验更具伦理优势。该技术在抗蜱血清评估中的应用极具价值，还有助于开发重组抗毒素疗法。未来的研究应致力于构建能检测所有19种全环毒素类型的单克隆抗体组合。
引言
蜱虫属于蛛形纲中的吸血节肢动物，该纲还包括蜘蛛和蝎子。这类外寄生蜱虫是多种动物和人类疾病病原体的传播媒介，会引发宿主严重的瘫痪和过敏反应（Boulanger等人，2019年）。因此，蜱虫及其引发的蜱传疾病在全球范围内都对牲畜和人类健康构成威胁（Jongejan和Uilenberg，2004年）。
在已知的900种蜱虫中，约有75种能与蜱传瘫痪相关，其中大部分属于硬蜱类（Deng等人，2024年）。最具危害性的有毒蜱虫包括北美的Dermacentor andersoni和Dermacentor variabilis，非洲的Ixodes rubicundus、Rhipicephalus evertsi everts和Argas (Pericargas) walkerae，以及澳大利亚的Ixodes holocyclus（Neumann，1899年；东部麻痹蜱）（Russell和Burch，1959年；Deng等人，2024年）。分布于澳大利亚东海岸的Ixodes holocyclus是毒性最强的蜱虫种类（Stone和Aylward，1987年；Hall-Mendelin等人，2011a年；Song等人，2011年）。它的危害范围很广，会影响多种动物，包括家畜，而袋狸是其主要宿主（Doube，1975年）。中毒症状最初表现为咳嗽、精神萎靡、声音变化、呼吸时发出哼声，有时还会出现呕吐。这些症状会迅速发展为后腿无力、步态蹒跚，最终导致完全瘫痪、呼吸衰竭，一般在24–48小时内死亡（Cooper和Spence，1976年；Campbell等人，2004年）。每年约有10万只家畜受到麻痹蜱的影响，其中多达1万只宠物需要接受兽医治疗（Stone和Aylward，1987年）。自澳大利亚开始使用异噁唑啉类杀虫剂以来，这一关于治疗数量的估算数值就再未更新过（澳大利亚农药与兽药管理局，2015年；2016年）。
全环毒素是一类体积较小（约5kDa）、具有神经毒性的多肽，大量存在于I. holocyclus的唾液中，正是它们导致了宿主的瘫痪症状。目前已发现的全环毒素异构体有19种，属于一个多基因毒素家族，这些毒素具有保守的半胱氨酸结构，可形成特征性的抑制性半胱氨酸结结构（ICK结构），不过它们的序列相似度（25–96%不等）、表达水平以及致瘫能力也存在差异（Rodríguez-Valle等人，2018年）。全环毒素具有协同作用，能够抑制突触前细胞释放乙酰胆碱，从而导致患病动物出现典型的上升性弛缓性瘫痪。尽管全环毒素在临床上有重要意义，但由于其含量较低、结构复杂，且传统上依赖体内新生鼠生物试验或离体突触小体试验，这类方法既存在伦理问题，操作上也较为繁琐，难以实现标准化（Stone等人，1982年；Hall Mendelin等人，2011a年；Viviani等人，2023年）。
目前治疗麻痹蜱症状的方法是使用犬用抗蜱血清，但该方法仅在疾病早期有效。这种血清是通过让狗反复接触麻痹蜱，使其产生高度免疫力后提取的。整个生产过程耗时且成本高昂，只能获得少量血清。此外，许多动物在使用大剂量外来血清蛋白后会出现过敏反应或血清病等不良反应（Atwell等人，2001年）。患有蜱毒症的犬猫还需要通过其他药物来控制呕吐、肺炎、高血压、心脏问题、对血清的过敏反应、喉咙痉挛以及呼吸困难等症状（Atwell和Campbell，2001年）。如果能够研发出针对全环毒素的单克隆抗体或针对I. holocyclus的疫苗，将会成为比现有抗血清疗法以及化学预防措施/咀嚼剂更有效的改善动物福利的手段。目前确实已经研制出了针对I. holocyclus的犬用抗毒素疫苗，但在澳大利亚尚未投入市场销售（Rodriguez-Valle等人，2021年）。
开发基于针对全环毒素的单克隆抗体的可靠酶联免疫吸附试验，对于替代现有的体内新生鼠试验（Stone等人，1982年）或突触小体试验（Rodriguez-Valle等人，2018年）至关重要。这类检测工具还有助于量化并规范蜱虫唾液腺提取物以及市售麻痹蜱血清制剂中全环毒素及其特异性抗体的含量。此前的ELISA试验只是使用粗制唾液腺提取物来检测犬血清中的毒素，并没有用到特定的全环毒素或针对特定毒素制备的单克隆抗体（Hall-Mendelin等人，2011年）。那种ELISA方法无法区分不同的全环毒素，也无法区分不同血清对不同全环毒素的反应，只能检测到唾液腺提取物的整体成分所引发的反应。而基于单克隆抗体的ELISA则能大幅提升在为宠物动物进行治疗前，对这类免疫相关疾病的诊断准确性。在这项研究中，研究人员选择了HT-1和HT-5两种全环毒素作为检测目标，因为它们在蜱虫叮咬的关键时期出现频率最高、含量也最充足（Rodríguez-Valle等人，2018年）。其中HT-1是最为研究透彻的毒素类型，它在突触小体试验中表现出生物学活性，且在体内环境中也能被中和。全环毒素家族中的HT5亚群在结构上与HT-1有所不同，从而形成了毒素多样性。值得一提的是，HT-1和HT-5都具有经过实验验证的线性B细胞表位，这些表位是通过Bepipred软件预测得到的，正是基于这些表位才得以制备出能够识别合成肽以及完整天然毒素的单克隆抗体。这些特性使得HT-1和HT-5成为开发灵敏、特异且可大规模应用的免疫测定方法的理想靶标。本文介绍了基于针对HT-1和HT-5的单克隆抗体的ELISA方法的研发过程，该方法可用于量化全环毒素，同时检测高免犬所产生的抗麻痹蜱血清制品中的相应抗体水平。
章节节选
麻痹蜱抗血清
2013年，我们从澳大利亚的三家生产商处购买了三种抗麻痹蜱血清，其名称及编号如下：Summerland Serum公司生产的纯化抗蜱血清，批次号为PA6，有效期至12月14日，简称为Sum；Australian Veterinary Serum Laboratories公司生产的Ixodes holocyclus抗毒血清，批次号为AAD，有效期至2月16日，简称为AVSL；Northern Serum公司生产的犬用麻痹蜱抗血清，批次号为234，有效期至9月15日，简称为Nor。我们还从之前没有出现过蜱传瘫痪症状的健康犬只身上采集了阴性血清样本，简称为Neg。
单克隆抗体筛选
首先，我们对8个针对HT-1和HT-5的B细胞结合预测肽#1和#2制备的杂交瘤细胞（h3B4、h3E2、h6E3、h7C6、h1E4、h5D4、h3B6和h3F1）的上清液进行了ELISA筛选。如图1A和1B所示，其中5个杂交瘤细胞——3B4、3E2、7C6、3B6和3F1——对肽#1（HT-1）或肽#2（HT-5）表现出较强的反应性。检测结果显示，3B4、3E2和7C6这三种单克隆抗体的滴度约为7,290。
讨论
本研究旨在开发基于单克隆抗体的ELISA检测平台，用于检测和定量Ixodes holocyclus的全环毒素，重点关注HT-1全环毒素。这项研究填补了蜱传瘫痪研究领域的空白，因为以往的定量分析和抗血清评估大多依靠体内小鼠生物试验或离体神经肌肉研究，这类方法不仅存在伦理争议，而且工作量极大。
结论
总而言之，本研究开发的基于单克隆抗体的ELISA检测平台，在全环毒素的检测和定量方面取得了重大突破。这类检测方法具有重复性好、灵敏度高且更符合伦理要求的优势，能够替代传统的体内试验，为抗血清标准化、毒素研究以及潜在的临床诊断提供实用工具。此外，通过表面等离子体共振技术分析得到的高亲和力单克隆抗体，也证明了相关技术在实际应用中的可行性。
CRediT作者贡献说明
Beibei Chen：负责写作——审稿与编辑、方法验证、研究设计。 Alicja E Tabor：负责写作——审稿与编辑、研究指导、资源协调、资金申请。 Manuel Rodriguez Valle：负责写作——初稿撰写、研究指导、数据整理与分析、概念构思。
未引用参考文献
澳大利亚农药与兽药管理局，第10页；澳大利亚农药与兽药管理局，第18页；Gutiérrez等人，2011年；Karlsson和F?lt。
利益冲突声明
? 作者声明存在以下可能被视为利益冲突的财务利益/个人关系：Alicja E Tabor表示获得了昆士兰大学的财政支持，同时还与澳大利亚研究委员会存在合作关系，包括获得资助项目。其他作者则表示自己不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
澳大利亚研究委员会提供的链接资助项目LP120200836，以及澳大利亚Elanco Animal Health公司的支持，为这项研究提供了经费保障。作者们还要感谢昆士兰大学化学与分子生物科学学院的名誉教授Ross Barnard，感谢他允许我们使用本研究中所用的Biacore检测设备。
Manuel Rodríguez Valle|Beibei Chen|Alicja E. Tabor
昆士兰大学，昆士兰农业与食品创新联盟（QAAFI），动物科学中心，80号楼，306 Carmody Rd，圣卢西亚，昆士兰州4067，澳大利亚
