《ChemPhysChem》：Dual-Laser Laser-Induced Liquid Bead Ion Desorption Mass Spectrometry: A New Approach for Adjustable Softness and Higher Sensitivity
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天然蛋白质复合物（Protein complexes）的生物力学研究对于理解结构特征、组装路径以及动态相互作用至关重要。随着样品复杂性的增加，目前的分析平台已达到性能极限，这突显了对改进仪器的需求。LILBID-MS已被证明是一种非常适用且能够有效鉴定亲和力、
天然蛋白质复合物（Protein complexes）的生物力学研究对于理解结构特征、组装路径以及动态相互作用至关重要。随着样品复杂性的增加，目前的分析平台已达到性能极限，这突显了对改进仪器的需求。LILBID-MS已被证明是一种非常适用且能够有效鉴定亲和力、复合物、化学计量比和组装路径的天然质谱（Native MS）方法，即使对于具有挑战性的膜蛋白（Membrane proteins）也同样适用。在LILBID-MS中，包含样品的微液滴受到中红外（Mid-IR）激光脉冲照射，导致样品解吸进入气相，且无需额外的主动充电，从而保留了类天然相互作用。离子产率与源内解离（In-source dissociation）均依赖于激光能量，这在信号强度与软电离条件之间造成了权衡。提高激光能量会增加离子计数，但同时也会加剧源内解离；因此，微弱的蛋白质相互作用难以被检测到。在此，研究人员提出了一种双激光LILBID-MS方法，该方法采用两个具有独立可控强度和时间延迟的激光脉冲。这种新设置允许在不依赖离子计数的情况下优化源内解离程度。这种增强的控制能力提供了适应样品特定需求的选项，例如允许进行以前无法实现的软条件测量。
非共价相互作用（Noncovalent interactions）在理解细胞过程中具有根本性的重要意义。天然质谱（Native MS）是一种可靠的分析非共价相互作用的技术，能够在近生理条件下观察蛋白质复合物（Protein complexes）。在各类天然质谱方法中，激光诱导液滴束离子解吸质谱（LILBID-MS）已被证明在观察脆弱的非共价相互作用方面具有卓越表现。LILBID-MS的中红外（Mid-IR）激光软电离是通过将水溶液样品的微液滴引入质谱仪中实现的，水分子吸收激光能量后产生爆炸性膨胀，使样品解吸进入气相且不主动为蛋白充电。然而，LILBID-MS的一个主要局限性在于解吸激光能量与离子产率及源内解离（In-source dissociation）之间存在内在相关性。提高激光强度虽能增加脱附效率，但同时会导致能量密度上升，引发更严重的复合物解离，这在灵敏度与软度之间形成了一个权衡机制。在低激光能量下，液滴接收充足激光照射的部分有限，产生大量次级小液滴并将分析物包裹其中，导致脱附效率受限；而膜蛋白（Membrane proteins）由于嵌入脂质微团或洗涤剂聚集体中，需要极高的能量才能有效释放，这进一步加剧了维持非共价键完整性与获得足够离子产率之间的矛盾。为了解决上述问题，研究人员开发了一种双激光LILBID方法，该方法采用两个带有可调延迟和能量的独立激光脉冲。其基本假设是，在短暂延迟后提供的第二个激光脉冲重新照射初始爆炸产生的子液滴，从而扩大有效红外照射体积并增加解吸离子产率。这一两步法允许降低每次脉冲的能量，从而实现更温和的离子气相转移。研究人员通过一系列实验展示了该方法在提升灵敏度和调节软度方面的卓越性能，并成功应用于先前单激光方法无法分析的膜蛋白稳定性差异研究。该研究成果已发表在《ChemPhysChem》期刊上。
在关键技术方法方面，研究人员构建了一套双激光LILBID离子源装置，通过引入与既有激光平行的额外中红外激光，利用脉冲发生器实现对两束激光脉冲顺序和时间的精确同步触发与延迟控制。样品借助压电驱动微滴发生器引入。研究采用牛血清白蛋白（BSA）、伴刀豆球蛋白A（ConA）以及来源于纳米嗜盐古菌（Nanosalina）的膜蛋白视紫红质（NsXeR）野生型及F50Y与R100K突变体作为研究模型。样本队列中的野生型及突变体视紫红质通过构建质粒并在大肠杆菌C43(DE3)菌株中表达提取，随后耦合至飞行时间（TOF）质量分析器获取质谱信号，并通过自定义脚本完成数据的数字化及背景扣除后的峰面积积分处理。
研究结果
实验设置
研究人员的双激光LILBID配置将额外的中红外激光（L2）引入设置中，其几何结构与预先存在的激光（L1）平行。研究人员将两束激光的脉冲能量（E1和E2）以及两束脉冲之间的时间延迟定义为参数组合。由于两束激光的焦点体积存在微小差异，照射顺序会影响结果，因此研究人员将负延迟定义为L2在L1之前触发的条件，正延迟则相反。评估延迟时间和激光能量的变化如何影响灵敏度、软硬度及整体适用性是核心所在。
检测限
研究人员选取牛血清白蛋白（BSA）作为模型系统来评估双激光方法增强解吸效率和改善检测限的能力。研究发现，在10 μM至100 nM的浓度范围内，所有激光能量和延迟下均可轻易检测到BSA。但在10 nM浓度下，单激光脉冲或两个同时发生的激光脉冲均无法产生质谱；相比之下，采用0.1至0.2 μs之间的延迟且每束激光脉冲能量至少为7 mJ的连续照射，能够稳定且可靠地检测到BSA信号。这表明两步照射序列显著提高了离子化效率。延时双激光设置所产生的信噪比（S/N）优于无延迟设置，且使检测限降低了近一个数量级。在更低的5 nM浓度下，在任何条件下均无法获得BSA信号。
软度
研究人员选择伴刀豆球蛋白A（ConA）作为模型蛋白来调查双激光设置能否缓解离子释放与源内解离（In-source dissociation）之间的相关性。ConA在生理条件下以四聚体复合物形式存在。研究人员通过系统变化两束激光的能量（4、7、10 mJ）及延迟时间进行扫描分析。结果表明，在低能量组合配置下，可以获得软电离条件，质谱主要由四聚体信号组成，且未检测到三聚体物种，表明该方法未引发源内解离；而在提高激光能量时，局部能量密度的增加促进了复合物解离，导致质谱中单体物种占据主导地位，反映了苛刻条件。同时，研究人员发现延迟时间为0 μs的设置总是导致给定激光能量下最苛刻的条件，且信号强度大幅下降。通过系统调整延迟和能量，可以精确引导测量走向软、中或硬的脱附条件。
膜蛋白
由于膜蛋白与洗涤剂之间存在强烈且持久的结合，研究人员将其作为双激光方法的测试案例。研究人员将该方法应用于微生物NsXeR野生型及F50Y和R100K突变体。测量显示，在单激光高能量下，质谱无法清晰分辨突变对寡聚化的影响。通过应用双激光方法，研究人员发现尽管膜蛋白需要比可溶性蛋白更高的激光能量才能从去污剂胶束中释放并产生合理信噪比的质谱，但负延迟配合调整后的激光能量能够实现软测量。在软条件下，野生型的主要物种转变为三聚体；而R100K和F50Y突变体即使在此温和条件下也主要呈现Monomer和Dimer物种，并表现出意外但明显的四聚体复合物特征。这表明突变改变了寡聚化机制，可能导致替代界面的稳定或引发非预期聚集，从而帮助研究人员得出关于突变对天然寡聚状态细微影响的明确结论。
结论
综上所述，研究人员成功建立了一套双激光LILBID装置，通过使用两个独立触发且具有可调延迟和能量的激光脉冲，成功解耦了液滴碎裂与离子释放过程，克服了单激光方法中离子释放与软条件测量之间固有的权衡问题。该装置显著增强了质谱分析的灵敏度，使检测限降低至低纳摩尔浓度水平。通过热量图对参数组合的分析表明，能产生最大软度或硬度的参数并不总是最佳选择，因为它们可能伴随信号强度的损失。研究人员通过结合信号强度与复合物软硬度比值提出了选择指数，以便根据测量目的确定最优的激光能量与延迟参数。这种方法在可溶性蛋白和膜蛋白复合物中均展现了出色的分析能力，使得以往由于无法控制的解吸诱导解离或离子产率不足而无法测量的不稳定系统变得可测。该研究不仅推进了对视紫红质等膜蛋白的结构和功能研究，也为在有限蛋白样品条件下进行突变筛选或药物结合研究开辟了新途径，进一步巩固并提升了LILBID-MS在复杂生物分子组装体结构、机制及功能研究中的能力。
